Способ получения -1,6-гликозидаз

Способ получения -1,6-гликозидаз

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

011 469267

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Зависимый от патента— (22) 3 аявлено 01.04.69 (21) 1319130/1838524/

/28-13 (51) 1. Кл. С 12d 13/10 (32) Приоритет 01.04.68 (31) 21364/68 (33) Япония

Опубликовано 30.04.75. Бюллетень ¹ 16

Государственный комитет

Совета Министров CCCP по делам изобретений н открытий (53) УДК 577.15.08 (088.8) Дата опубликования описания 14.11.75 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Канаме Сугимото, Мамору Хирао, Кацуо Масуда и Сузо Сакаи (Япония) Иностранная фирма

«Хаясибара Компани> (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ а-1,6-ГЛЮКОЗИДАЗ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к получению ферментов с помощью микробного синтеза.

Известен способ получения а-l,б-глюкозидаз путем культивирования их продуцентов на водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические соли.

С целью повышения выхода а-l,б-глюкозидаз предлагается в качестве продуцента использовать штамм Micrococcus lysodeicticus

IFO 3333.

Сущность описываемого способа заключается в том, что штамм выращивают в питательной среде, содержащей растворимый крахмал, пептон, дрожжевой экстракт, соли фосфора, магния, натрия и железа, в условиях аэрации на качалке при 30 С.

Рост определяют по изменению коэффициента поглощения культу ральной жидкости, разведенной 10 раз, при длине волны 660 ммк, рН измеряют потенциометрически.

Активность фермента определяют следующим образом: к реакционной смеси, содержащей 5 мл 1%-ного раствора растворимого рисового крахмала и 1 мл (0,5 моль) ацетатного буфера, добавляют 1 мл раствора, содержащего испытуемый фермент. Смесь выдерживают при 40 С в течение 30 мин.

Из этой смеси по ходу реакции отбирают пробы по 1 мл. Каждую отобранную пробу добавляют к 30 мл смеси, состоящей из 0,01 н. раствора серной кислоты и 0,01 н. раствора йод-йодистого калия. Смесь становится пурпурной и через 15 мин определяют коэффициент поглощения этого раствора при длине волны 620 ммк.

Величина прироста коэффициента поглоще10 ния раствора в процессе протекания ферментативной реакции (в начале реакции и через

30 мин) является показателем ферментативной активности. В этих условиях прирост коэффициента поглощения на 0,01 соответствуl5 ет 1 единице ферментативной активности. а- l,б-глюкозидазы, синтезируемые штаммом М. Iysodeicticus IFO 3333, имеют следу ющие свойства.

Оптимум рН 5,5 — 6,0

20 Температурный оптимум 45 С рН вЂ” стабильность 5 — 8 (фермент быстро инактивируется при рН 5)

Термостабильность Фермент бысТр0 HHактивируется при 40 — 45 С.

Специфичность к субстратам:

Картофельный крахмал +

469267

Предмет

Составитель Л, Минеева

Техред Г. Дворина

Корректор Т. Гревцова

Редактор Т. Пилипенко

Заказ 2745!15 Изд, Хв 1406 Тираж 529 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

Рисовый крахмал +

Декстран

Пуллулан +

Гликоген

П р и м е ч а н и е: + — йаличие аквивности — — отсутствие активности.

Пример 1. Штамм М. lуsodeicticus

IF0 3333 выращивают на среде следуюц,его состава, /о ..

Пептон 1,0

Дрожжевой экстракт 0,5

К,НРО, 0,1

NaC1 0,05

M oS0. 7H O 0,05

0,001

Растворимый крахмал 1,4

Выращивание осуществляют в колбах па качалке ui)H 30"С B течение 4 cуток.

Общая ферментативная активность, определяемая описанным выше способом, составляет 7,4 ед/мл, из них внеклеточная активность равна б,б ед/мл.

Пример. 2. Получение фермента из пггамма М. Iysodeicticus IFO 3333 и изучение его своиств.

Питательную среду, содержащую, /,:

Мал ьтоза 1

Пеп тон 0,5

Дрожжевой экстракт 0,25

Мочевипа 0,2

Мясной экстракт 0,2

К2Н РО4 0,1

КСI 0,05

МдЯО 7Н О 0,05 засевают 2% посевной культуры испытуемого штамма.

Выращивание осуществляют в специальной емкости, содержащей 20 л среды, при 30 С в условиях аэрации и при перемешивании среды мешалкой, делающей 200 об/мин.

Начальный рН среды 7,0. Через 3 суток (после окончания выращивания) рН равен

8,2.

Бактерии отделяют от среды центрифугпрованием, промывают один раз водой.

0,1 /о -ный раствор додецилсульфата натрия в растворе буфера рН 7 суспендируют в соотношении, равном 1:10 по объему в культуральной кидкости, и проводят автолиз на качалке при 30 С в течение 48 час.

После центрифугирования в надосадочную жидкость добавляют сульфат аммония до

0,8 от насыщения.

Из выпавшего в результате высаливания осадка соответствующим количеством воды экстрагируют фермент, после чего осадок дпялизуют. По окончанию культивирования внутриклеточная ферментативная активность составляет 39,2 ед/мл, внеклеточная — 12 ед/мл.

После очистки раствор фермента подвергают исследованию с целью изучения его активности.

Оптимальный рН фермента равен 5,5, оптимальная температура — 42"С. При температуре выше 50 С фермент быстро теряет активность. То же имеет место при рН среды ниже 5.

Характеристика используемого штамма

ticrococcus Iysodeicticus I FO 3333 следующая.

Кокки диаметром 1,0 — 1,2 мк неподвижные.

Грамположительные. На желатине колонии от желтовато-белого до желтого цвета с Волнистыми краями. Столбик с желатиной ис разжижаетт.

1-Iа агаре колонии небольшие, укелтозатые, с блеском. На укидкой среде — образуют желтоватый осадок. Лакмусовое молоко e коагулирует, реакция слабокислая.

На картофельном агаре колонии с блеском, лимонно-желтого цвета. Индол не образует.

Образует кислоту на глюкозе, сахарове и манните. На лактозе кислоту не образует. Крахмал це гидролизует. Нитраты до нитритов пе

Восстанавливает.

В качестве источника азота использует

КН4Н.РО4, аммоний виннокислый. Рост проявляется по истечении б недель в растворе по

Кону. Сапрофит. Аэроб. Оптимальная темпе40 ратуря 25 С.

Способ получения о.- l,б-глюкозидаз путем

15 культивирования их продуцентов на входной

nHraTe oÉ среде, содержащей;fact (»1Hv1

Iysodeicticus IFO 3333.