Патент 469268

Способ получения -1,6-глюкозидазы

 

1 ! (.:А::Н И

ОП И

ИЗОБРЕТЕНИЯ (1п 469268 боюв Советских

Социалистических

Республик к латинтм (61) Зависимый от патента (22) Заявлено 01.04.69 (21) 1319130/28-13 (32) Приоритет 01.04.68 (31) 21364/68 (33) Япония

Опубликовано 30.04.75. Бюллетень М 16

Дата опубликования описания 03.09.75 (5!) М. Кл. С 12d 13/10

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 577.15.08 (088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Канаме Сугимото, Мамору Хирао, Кацуо Масуда и Сузо Сакаи (Япония) Иностранная фирма

«Хаясибара Компани> (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ а-1,6-ГЛЮКОЗИДАЗЫ

Таблица 1

Специфичность к субстратам

R-энзнма из риса, фасоли (бобов) картофеля, ячменя пуллуланазы из бактерий изомеразы нз дрожжей

Субстрат

Крахмалы

R-ограниченные декстрины

Гликогены

Декстраны

Пуллуланы

Изобретение относится к ферментной промышленности, а именно к способам получения а-1,6-глюкозидазы.

Известен способ получения а-l,б-глюкозидазы путем культивирования ее продуцентов на 5 питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли.

Целью изобретения является повышение активности а-l,б-глюкозидазы.

Достигается это тем, что в качестве про- 10 дуцентов используют бактерии, относящиеся к роду Lactobacillus.

Из рода Lactobacillus используют штаммы

Lactobacillus gayonii АТСС 8289, Lactobacillus pIantarum АТСС 8008, Lactobacillus brevis 15

IFO 3345, Lactobacillus brevis IFO 3960, Lactobacillus bulgaricus IFO 3533.

Известны ферменты, способные селективно гидр олизовать а- l,б-глюкоз иди ые связи в глюкозе и отличающиеся один от другого раз- 20 личной ферментативной активностью, благодаря чему их классифицируют на три типа: изомеразы, пуллуланазы и R-энзимы.

Полученные ферменты могут быть примене- 25 ны для утилизации крахмала и других аналогичных продуктов разложения, таких как гликогены, декстрины и пуллуланы. Обнаружено, что изоамилазы и R-энзимы, полученные из дрожжевых культур и растений, имеют 3О очень низкую активность и очень низкие оптимальные температуры (от 20 до 40 С), в то время как пуллуланазы, выделенные из бактериальных сред, имеют относительно высокую активность, причем эта активность в наибольшей степени проявляется при температуре, лишь немного превышающей 45 С. Поэтому, чтобы найти ферменты, которые обладали бы специфичностью по отношению к различным субстратам и были пригодны для использования в тех случаях, когда необходима более высокая специфичность, а также ферменты, которые бы обладали улучшенной теплостойкостью и активностью, были предприняты исследования бактерий, производящих а- 1,6глюкозидазы.

469268

1;ря этом учитывалось следующее явление: если какои-" о штамм вырабатывает фермент, имеющий Q,-l,б-глюкозидазную активность, то при добавлении к нему раствора, содержащего крахмал и йодистый калий, раствор приобретает синюю окраску.

Было отобрано таким образом определенное количество штаммов, относящихся к бактериям вида Lactobacillus. Эти штаммыкультивировались на культуральных средах, предназначенных для аэробных молочнокислых бактерий. Для культивирования каждого штамма брали 100 мл культуральной жидкости, температуру которой поддерживали на уровне 30 С.

Энзиматическую активность определяли, используя супернатант (надосадочная жидкость), полученный в результате центрифугирования культуральной жидкости.

Каждую композицию, состоящую из 5 мл

1 "/о-ного ожиженного клейкого рисового крахмала, 1 мл 0,5 М уксуснокислого буферного раствора и 1 мл раствора, содержащего испытуемый фермент, выдерживали при температуре 40 С в течение 30 мин.

Из реакционного раствора с момента начала реакции ферментолиза и до его завершения отбирали аликвотные пробы объемом

1 мл. Последнюю пробу отбирали спустя

30 мин после начала реакции. Каждую отобранную из раствора пробу выливали в смесь

30 мл 0,01 н. раствора серной кислоты и

O,Ol н. раствора подйодистого калия. Смесь становилась пурпурной, и спустя 15 мин определяли ее коэффициент экстинкции (т, е. поглощения) при длине волны видимого света

620 ммк. Величина прироста коэффициента экстинкции реакционного раствора, полученная в результате измерения в начале реакции ферм ентолиза (при «нулевом» времени) и спустя 30 мин, рассматривалась в качестве критерия ферментативной активности.

В этих условиях абсолютное увеличение (прирост) коэффициента экстинкции на 0,01 соответствует единице энзиматической активности.

Из бактериальных штаммов, исследованных на активность по описанной выше методике, применялись штаммы, принадлежащие к видам, которые продуцируют больше ферментов во внешней среде, окружающей клетки, чем в самих клетках, в частности Lactobacillus

plantarum. Эти штаммы культивировались в специальных банках и затем очищались для дальнейшего исследования ихэнзиматическото поведения и специфичности по отношению к различным субстратам.

Степень размножения бактерий в культуральных средах определялась по изменению коэффициента экстинкции каждой культуральной жидкости, разбавленной в 10 раз, причем коэффициент экстинкции измерялся при длине волны 660 ммк. 3а изменением рН культуральной жидкости следили при помощи стеклянных электродов.

55 бО

Лэробные штаммы вида Lactobacillus куль тивировались в специальных банках в условиях аэрации при 30 С в течение 3 дней.

Штаммы подвергались очистке посредством автолиза культуральных сред, высаливания из раствора сульфатом аммония и двукратного диализа супернатанта.

Энзимы бактерий вида 1.actobacillus имеют более высокую оптимальную температуру ((50 С) и более, высокую теплостойкость.

Отсюда можно сделать вывод, что энзимы бактериальных культур вида Lactobacillus в большей степени приспособлены для промышленного использования. Оптимальная область рН для энзимов вида Lactobacillus равна 5,5, но они остаются активными и при относительно низких значениях рН.

Специфичность ферментов по отношению к различным субстратам оценивалась следующим образом: субстрат подвергали воздействию Р-амилазы, являющейся одним из энзимов группы <х-1,6-глюкозидазы, и затем определяли скорость энзиматического разложения субстрата. В качестве субстратов для этой цели использовали картофельный крахмал, рисовый крахмал, р-предельный декстрин, гликоген, декстран и пуллулан. Скорость разложения пуллулана оценивалась по скорости накопления в реакционной среде мальто-триозы, которая получается в результате ферментативного гидролиза пуллулана, а скорость разложения других субстратов оценивалась по тому, с какой скоростью в реакционной среде накапливалась мальтоза — продукт ферментативного гидролиза этих субстратов.

Указанные три типа ферментов обладают постоянной активностью по отношению к 1,6связям в крахмальных системах, но все эти три типа ферментов являются практически неактивными по отношению к декстрану.

Ферменты бактериальных штаммов вида

Lactobacillus по своим энзиматическим свойствам относительно а-l,б-глюкозидов очень похожи на пуллуланазы вида Aегоbacter.

Пример 1. Производство а-l,б-глюкозидаз бактериальными культурами.

В результате йод-крахмальной реакции находят штаммы бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus.

Эти штаммы культивируют в колбах, а затем испытывают на энзиматическую активность.

10 мл культуральной среды, имеющей состав, указанный ниже, засевают с помощью небольшой платиновой ложечки испытуемым штаммом, после чего его культивируют 4 дня при температуре 30 С. Аэробные бактерии культивируют при перемешивании и вибрации питательной среды, в то время как молочнокислые бактерии культивируют в стационарных условиях.

Состав культуральной среды (/ ) для бактерий:

469268

NUTSOò.7Н .О 0,050 0,050

FeSO, ?Н О 0,001 0.001

Разжиженный крахмал 1,400 0,700

Мальтоза — 0,500

Данные, полученные в результате культивирования, представлены в табл. 2

Таблица 2 аэробных молочнокислых

1,000

1,000

Пептон

Дрожжевой экстракт

К НРО.

NaC1

0,500

0,100

0,050

0,500

0.100

0,050

Энзиматическая активность, ед.! мл внеклеточная внутриИспытуемый штамм общая

LactobaclIIus brevfs 4,7 If O 8345

LactobacfIlus brevfs 4,8 1РО 3960

Lactobaclllus bulgarfcus 3,9

LactobaciIIus gavonff АТСС 8289

1.actobacfllus plantarum 3,8 АТСС 8008

2,1

0,3

1,3

3,5

1,5

2,7

3,6

2,0

3,9

З,б

3,0

4,9

2,0

7,4

Данные о энзиматической активности и специфичности изоамилазы по отношению и пазличным субстратам предстаглены в табл. 3.

Таблица 3

Свойства изоамилазы

Показатель из бактерий вида Lsctobacfllus растительного происхождения из дрожжей !

5,0 — 5,5

6,0 — 6,2

6,0 — 9,0 (Быстро дезактивируется при рН 5) (25

5,0 — 6,0

<50

5,0 — 6,5 (Быстро дезактивирчется при рН 4,5) (57

Оптимум рН

Оптимальная температура, С

РН-стабильность (Быстро дезактивиргется при рН 5) (45

Температура дезактивации, С

Специфичность к субстрзтам; картофельный крахмал рисовый крахмал

8-предельный декстрин декстран пуллулаи гликоген

ll p и м е р 2. Получение энзимов из Lactobacillus plafItarum и изучение их свойств.

В этом примере используют культуральную среду того же состава, что и в примере 1.

Культивирование бактерий в каждом случае осуществляют в 1 л культуральной жидкости при 30 С и перемешивании в течение

3 дней. Полччены следующие результаты: припост рН 0,95 — 4,0, активность внеклеточная

16. внутриклеточная 17, общая 33.

Раствор фермента штамма Lactobacillus

plantarum получают насыщением с пернатанта (надосадочнотт культура чьттотт жичкости) сульфатом аммония до по,ч .ченття 0.8 насыщенного раствора. Выпавший осадок отделяют пентрифугированием, растворяют тт воче и диализуют против волы в течение одного дня.

Раствор Lactobacillus максимальнчю активность проявляет при значениях рН от 5 до

6.5. При определении оптимальной температу.— ры установлено, что раствор Lactobacillus не теряет,. активности вплоть до температуры

55 С, что указывает на .высокую теплостойкость этик ферментов по сравнеттттто с другиПри определении специфичности исслелуемьтк Ферментов по отношению к различным субстратам получают и подвергают очистке

15 ряд субстратов, чистота которых устанавливается при помощи бумажной хроматографии.

В число этик субстратоз входят: кракмал картофельный и рисовый, I)-предельный декстрин, лекстпан, глпкоген и пуллулан.

20 Эти субстраты подвергают одновременному воздействию какого-либо одного из испытуемых энзимов и Р-амилазы, причем полученные результаты выражают путем опенктт скорости накопления в реакционной среде мальтоз

25 Ifлтт мальто-тпиоз. Ферметтттт )aêòåãèa, òhII »Iê культур вила Lactnbacil)us не об,чалатот способностью различать этот субстрат.

В табл. 4 приведены данные, показывающие

30 процентное содержание в реакционной смеси низкомолекулярных сахаров-мальтозы (мальто-триозьт), рассчитанное на общее содержание сахаров в реакционной смеси.

469268

Таблица 4

8-Амилаза +

+-энзим, полученный из

LactobaclIIus

Без,.-Амил

Субстрат энзима лаза

Крахмал картофельный

Крахмал рисовый

11,5

67,8 (56,3)

58,8 (53, О)

43,4 (37,1)

13,7 (7,4)

I1,2 (0,4)

32,6 (0,2) 5,7

95,1 (89,4) Гликоген

6,3 -Предельный декстрин

Декстран

7,9

10,8

10,0 (0)

120,0 (87,6) Пуллулан

32,4

Реакционная смесь (мл);

Субстрат (1%) 50

Ацетатный буфер (0,5 М, рН 6,0) 1

Р-Амилаза (5 единиц) 1

Цуллулаттяза 1, Общее содержание сахаров оценивается при помощи антропного метода, а концентрация в реакционной смеси низких сахаров оппеделяется по методу Сомоги — Нельсона. Образцы р-предельного декстрина, 8-a т .пазы, мальтозы. пчллчланя и мальто-трттозт:т. к топые исlIOJTb3VIOT ПРИ ППОПЕЛЕННП ттц ттт.ттаттттй. ттп.т тают в лаборатории, я нх чистота чстачяв.fHRRется при помотци бума .<:IoII хроматогряфнн.

Хяпактепистики ттттям;тон Lactobacillus

Lactnbac illus Ря опт1 АТСС 8289 (LactobaciIIus fermeIItum АТСС 828о) Палочки размером от 0.5,чо 1,0 мк. от 3.0 до 15.0 мк в паре или в цепочке. Неподвижны. Грамположительньт.

Опгапическая среда. Ня спеде, содемкатттей доожжевой экстракт-глюкозч — желатин, разжижение желатина не няблтодается.

Агап. Колонии плоские, кольцевые, небольIIII e. прозрачные.

На косом агаре наблюдается незначительный рост.

На жидкой среде. Бульон мч тный, осветляется по истечении нескольких дней.

Молоко не свертывает или сверты1-",ает слегка.

Восстанав,чивяет лакмчс, метиленовый голчбой. индигокармин, тиосчльт1тат натрия. Из

Na.SO, восстанавливает Н.S. Образует кис.чотч из глюкозы, фрчктозы, мальтозы. сахарозы. ляктозы, маннозы. галактозы, раффинозы.

Арабинозу, рамнозу, сорбит, маннит, итт лит. декстрин, крахмал и си,чицин сбражизает.

При бпожении альдогексоз образует молочнчю кислотi (оптическтт недеятельна), чкс сную кислоту, этиловый спирт и двчокись чглерода.

При брожении фруктозы образуется vaHI!Äi.

Нитраты в нитриты не восстанавливает.

Микроаэрофильные. Температуры: оптимальная 41 — 42 С, миттттмяльная 5 — - .8 С, максимальная 48 — 50 С.

Lactohacillus plantarum АТСС 8008

Палочки с закругленными краями размером

0,7 — 1,0 и 3,0 — 8,0 мк, отдельные или в виде коротких цс"..очек. Грам.тположнтсльны.

Прн посеве уколом на желатин, дро>кжc".oé экстракт, глюкоза: рост нитепндный, разжижения не наблюдается.

На косом агаре незначительный рост.

На жидкой срече образует муть, осветляется по истечении нескольких дней.

Лакмусовое молоко: кислое, коагулированное.

Образует кислоту из глюкозы, фруктозы, маннозы, галактозы. арабинозы, сахарозы, мальтозы, лактозы, рафтриттозьт, салицина, и в меньшей степени, из сорбита, маннитя, декстрина, глицерина и ксилозы. Рамнозу, крахмал и инчлин не сбпаживает.

Пои брожении гексозосахаров обпазчет молочнчю кислотч (оптически недеятельна1 только с небольшими количествами уксусной кислоты и двуокиси углерода.

Из пентоз обпазчет уксусные и молочные кислоты. Нитптттьт не восстанавливает в нитттятьт в обычном бчльоне. Микпоаэрофильные

»мператчра развития 10 — 40 С, оптимальная

30оС

Солевыносливость: растет на среде, содержащей 5,5% соли.

I actobaci1Ius brevis IFO 3345

LactobaciIlus brevis IFO 3960

Палочки размером 0,7 — 1,0 и 2.0 — 4.0 мк с закпчгленньтми кпаями, встречаются по очной и в виде коротких пеночек, ре,чко в длинных нитях, котопые могчт иметь cbopMU гранул.

Нпопп "жтттт Гттятммт очожительны. желатин не разжижает.

Ня косом агапе -тезначительный рост.

На жидкой среде обпазт ет м ть, осветляется по истечении неско.чьких дней, Из молока образует кис.чоту. Не пязрушяет казеин.

В качестве источника чг,чепопя использчет диктат кальция. Обпязчет кислотч из арабичозы. кси.позы. глюко ы. фр ктозьт, га,чактозы и мя.чьтозы.

Ся. тини:т. мячнттт, глицерин, пямнозч, декстпин, инчлин и кпахма. I педко cciIIàæèâàåò.

При брожении яльдогексоз обттяз ет мо,чочную кислотч (оптически недеятельна). чксчснчто кислотч, этиловый спипт и двчокись vrлепода. При бпожении фруктозы образуется маннит.

Из пектоз восстанавливает уксчснчю и мо.чочт-тч ю т ттслотч. Течпеттатура развития 15—

38 С, оп-.имальная 30 С.

469268

Lactobacillus bulgaricus IFO 3533

Предмет изобретения

Составитель Г. Субботина

Редактор Н. Спиридонова Текред Г. Дворина

Корректор Е. Рогайлина

Заказ 1820/5 Изд. Ко 1475 Тираж 529 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, K-35, Раушская наб., д. 4!5

Типография, пр. Сапунова, 2

Тонкие палочки с закругленными концами в виде цепочек. Неподвижны, Граммположительны.

Желатин и молочную сыворотку не разжижает.

Колонии плоские, желтовато-белые, диаметром 2 — 3 мм. Агар и молочная сыворотка: колонии кольцевые, асимметричные.

Молоко коагулирует при температуре 37 С.

Газа не образует. Казеин не разлагает. На картофеле не растет. Индола не образует.

Сбраживает глюкозу, лактозу и галактозу.

Не сбраживает ксилозу, арабинозу, сорбозу, рамнозу, дульцит, маннит, декстрин, инулин и крахмал, Сбраживает сахарозу и мальтозу. Образует высокую кислотность в молоке. Молочная кислота оптически недеятельна.

Нитраты не восстанавливает в нитриты.

Микроаэрофильны. Оптимальная температура развития 45 — 50 С, минимальная — 22 С.

1. Способ получения сс-l,б-глюкозидазы путем культивирования ее продуцентов на пита5 тельной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, отличаюшийся тем, что, с целью повышения активности к-l,б-глюкозпдазы, в качестве продуцентов используют бактерии, относящиеся к роду

10 Lactobacillus.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что из рода Lactobacillus используют штамм

Lactobacillus gayonii АТСС 8289.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, 15 что из рода Lactobacillus используют штамм

Lactobacillus plantarum АТСС 8008.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что из рода Lactobacillus используют штамм

Lactobacillus brevis IFO 3345.

20 5. Способ по п, 1, отличающийся тем, что из рода Lactobacillus используют штамм

Lactobacillus brevis IFO 3960.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что из рода Lactobacillus используют штамм

25 Lactobacillus bulgaricus IFO 3533.