Способ извлечения нуклеиновых кислот из микроорганизмов
Патент 470531
Авторы
Классы МПК
Способ извлечения нуклеиновых кислот из микроорганизмов
Иллюстрации
Реферат
О П И С А Н И E (и) 470531
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Союз Советских
Социалистических
Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 01.09.72 (21) 1825152/30-15 (51) М. Кл. С 12d 13/06 с присоединением заявки №
Государственный комитет
Совета Министров СССР по делам изобретений н открытий (23) Приоритет
Опубликовано 15.05.75. Бюллетень № 18
Дата опубликования описания 26.08.75 (53) УДК 547.963.3:576. .851.252 (088.8) (72) Авторы изобретения (71) Заявитель
М. Р. Медник и Л. Д. Шкроба
Киевский научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии и паразитологии (54) СПОСОБ ИЗВЛЕЧЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
ИЗ МИКРООРГАНИЗМОВ
Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к методам извлечения нуклеиновых кислот из микроорганизмов, в частности стафилококков.
Известен способ извлечения нуклеиновых кислот из микроорганизмов, включающий приготовление их суспензии, разрушение клеточных оболочек путем инкубации с лизоцимом и экстрагирование нуклеиновых кислот водонасыщенным фенолом. Однако этот способ не позволяет получить нуклеиновые кислоты с ненарушенной структурой из стафилококков из-за высокого внутриклеточного давления.
Целью изобретения является получение из стафилококков нуклеиновых кислот с ненар уш ен ной структур ой.
Поставленная цель достигается тем, что суспензию стафилококков перед инкубацией обрабатывают диэтилэфиром и центрифугируют ее на холоде. Кроме того, для достижения плазмолиза, выпавший осадок стафилококков обрабатывают 15 — 25%-ным раствором хлористого натрия с последующим добавлением бидистиллированной воды до достижения концентрации физиологического раствора.
Пример осуществления способа.
На подготовительной стадии выращивают стафилококки, например, штамма № 209. Для этого в трехметровые сосуды заливают по
350 мл мясопсптопной питательной среды с рН 7,3 — 7,4 и заливают ее 1 мл 18-часовой бульонной культуры стафилококка. Культивирование проводят в течение 6 час в термоs стате при 37 С на обкаточном аппарате для перемешивания среды. Затем сосуды охлаждают до 4 С и центрифугированием при
3000 об/мин в течение 50 — 60 мин отделяют стафилококки от культуральной среды, остат10 ки которой удаляют двукратной промывкой суспензии микробных клеток физиологическим раствором, содержащим 0,5% цитрата натрия для ингибирования нуклеаз и центрифугированием после добавления каждой пар15 тии промывного раствора в указанном режиме. После этого приступают к выделению нуклеиновых кислот. Микробные клетки суспензируют в 50 мл физиологического раствора и экстрагируют равным объемом эфира в тече20 ние 10 мин при интенсивном встряхивании.
Смесь центрифугируют в течение 45 — 50 мин при 4 С, при этом микробные клетки выпадают B осадок. На границе между верхним (эфир) и нижним (физиологический раствор)
25 слоями образуется кольцо, состоящее из липидов, экстрагированных при встряхивании.
Описанную экстракцию липидов проводят повторно. В результате удаления липидов в клеточных оболочках стафилококка образуют
30 поры.
470531
Составитель О. Сливкина
Текред Л. Казачкова
Корректор Е. Рогайлина
Редактор Н. Коган
Заказ 1970/14 Изд. № 1434 Тираж 529 Подписное
LIHHHHH Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий
Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Типография, пр Сапунова, 2
Микробные клетки, выпавшие в осадок, суспензируют в 2 мл 15%-ного раствора хлористого натрия в течение 10 мин при тщательном растирании и перемешивании, Такая обработка вызывает плазмолиз и способствует проникновению фенола к протоплазме стафилококка через поры, образовавшиеся в клеточных оболочках. К суспензии микробных клеток добавляют 28,1 мл бидистиллированной воды до достижения концентрации физиологического раствора и инкубируют с 30,1 мг лизоцима с концентрацией 1 мг на 1 мл инкубационной смеси в течение 3 ч в термостате при 37 С (лизоцим — препарат для разрушения клеточных оболочек микробов, выпускаемый венгерской фирмой «Реанал»). После инкубации смесь становится вязкой, что свидетельствует о разрушении клеточных оболочек и выходе нуклеопротеидов в раствор. Инкубационную смесь охлаждают до +4 С и из нее экстрагируют нуклеиновые кислоты равным объемом (30,1 мл) водонасыщенного фенола по методу Кирби-Георгиева.
Предмет изобретения
5 1. Способ извлечения нуклеиновых кислот из микроорганизмов, включающий приготовление их суспензии, разрушение клеточных оболочек путем инкубации с лизоцимом и экстрагирование нуклеиновых кислот водона10 сыщенным фенолом, отличающийся тем, что, с целью получения нуклеиновых кислот с ненарушенной структурой из стафилококков, перед инкубацией суспепзию обрабатывают диэтилэфиром и центрифугируют на холоде.
15 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью достиукения плазмолиза, выпавший осадок стафилококков обрабатывают
15 — 25%-ным раствором хлористого натрия с последующим добавлением бидистиллирован20 ной воды до достижения концентрации физиологического раствора.