Патент 480758

Способ получения -триптофана

 

()() 480758

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалнсткческнх

Ресоублнк (61) Зависимое от а вт. свидетельства (22) Заявлено 02.12.72 (21) 1854139/28-13 (51) М. Кл. С 12d 13/06 с присоединением заявки №

ГосУдаРственный комитет (32) Приори гег

Совета Министров СССР

Опубликовано 15.08.75. Бюллетень № 30 (53) УДК 663.18(088.8) н отквытнй

Дата опубликования описания 25.11.75 (72) Авторы изобретения

А. А. Прозоров, Н. И. Жданова, Г. А. Великжанина, Л. А. Минеева, А. П. Чулкова, А. Ф. Шолин, Е. P. Рошаль и Л. М. Евстюгов-Бабаев

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧEHИЯ 1;TPИПТОФАНА

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению 1-триптофана методом глубинной ферментации с помощью микроорганизмов.

Известен способ получения L-триптофана путем глубинного выращивания продуцирующих его оактерий Bacillus subtil)s. Генетика-37, не нуждающихся при синтезе 1-триптофана в предшественнике, на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода — мелассу, гидрол, пищевой сахар, в качестве источника азота — мочевину, куку.— рузный экстракт, а также необходимые минеральные соли, с последующим выделением

1-триптофана из культуральной жидкости и получением кристаллической аминокислоты.

Для увеличения выхода 1 -триптофана предлагается из микроорганизмов Bacillus subtilis использовать штаммы Генетика-2282 и Генетика-3557, при этом источник углерода вводить в среду. в количестве 150,0 — 100,0 г/л (по сахару), а источник азота — в количестве 15,0 — 10,0 г/л (по сухому весу).

Штамм Ген-2282 получен из штамма Ген-37 в итоге четырех последовательных ступеней отбора по признаку продуктивности при отработке клеток раствором N-метил-N-нитро-Nнитрозогуанидином в концентрации 500 мгк/мл и экспозиции в растворе 15 мин.

Штамм Ген-3557 получен в результате обработки клеток штамма l ен-2282 таким же раствором указанного мутагена и проведения двух ступеней отбора на продуктивность.

Культурально-морфологическая характеристика штаммов Ген-2282 и Ген-3557. Штаммы являются грамположительной спорообразующей палочкой. Колонии обоих штаммов на мясо-пептонном агаре после 24 ч инкубации

)О при 37" С достигают 8 — 10 мм в диаметре, сплошные, круглые, с изрезанным краем, поверхность — гладкая со слабой радиальной по краю и концентрической в центре исчерченностью. Посев каждого штамма штрихом на

IS мясо-пептонном агаре после 24 ч инкубации при 37 С дает умеренный рост, штрих — широкий с мелкозубчатым краем, запах — характерный, консистенция — рыхлая, маслянистая, цвет — серовато-белый. Рост каждого штамма на мясо-пептонном бульоне после 1 сут инкубации при 37 С характеризуется умеренным

«помутнением» среды без образования пленки, запах — характерный, осадок — скудный, тягучий при встряхивании, через 3 сут помутнение уменьшается.

Колонии на агаризованной минеральной среде Спицайзена с глюкозой после 3 сут инкубации при 37 С у штамма Ген-2282 достигают 0,8 — 1,2 мм в диаметре, сплошные, круг30 лые с гладкой блестящей поверхностью, гряз150,0 (по сахару)

15,0 (по сухому весу)

0,6

1,4

1,0

0,5

7,5

Кукурузный экстракт

КН,РО4

К2НРО4

MgSO4 ° 7Н20

NaC1

Мочевина

Водопроводная вода рН перед стерилизацией доводят щелочью до

6,8 — 7,0. Ферментационную среду без мочевины стерилизуют в ферментере при 124 — 126 С в течение 1 ч, после чего охлаждают до 37 С.

Мочевину в виде 40О/о-ного раствора стерилизуют отдельно при 0,5 ата в течение 30 иин и добавляют в основную среду перед посевом.

Ферментацию ведут в 20-литровых ферментерах, оборудованных турбинной мешалкой, барботером и системой автоматического пеногашения, при 37 С, непрерывном перемешпванип

3 но-белого цвета, внутренняя структура — однородная.

Штамм Ген-3557 образует в этих условиях точечные колонии, не превышающие 0,5 мм в диаметре.

При добавлении к среде 100 мкг/мл L-фенилаланина диаметр колоний достигает у штаммов Ген-2282 и Ген-3557 1,5 ма и 1,2 мм соответственно. Рост на жидкой минеральной среде Спицайзена (24 ч инкубации при 37 С, качалка) у штамма Ген-2282 характеризуется слабым струйчатым помутнением среды, у штамма Ген-3557 — помутнение еще более слабое. Рост обоих штаммов в указанных условиях стимулируется 1 -фенилаланином. Отношение к Р1 -5-метилтриптофану. Оба штамма при посеве на чашки Петри со средой

Спицайзена, содержащей 1000 мкг/мл DL-5метилтриптофана и 20 мкг/мл I -фенилаланина способны образовывать колонии (100 /о выживаемости) при некотором замедлении роста и уменьшении диаметра колоний.

Пример 1. Культуру Bacillus subtilis

Ген-3557 поддерживают на столбиках с 0,7 /оным агаром Хоттингера. Для выращивания посевного материала односуточную культуру, инкубированную при 37 С, пересевают в колбы Эрленмейера объемом 750 мл с посевной средой следующего состава, г/л:

Сахар-сырец 50,0

Кукурузный экстракт 20,0

КН Р04 0,6

КН2Р04 1,4 рН посевной среды доводят при помощи

NaOI- до 6,8 — 7,0. Среду стерилизуют 30 мин при 0,8 атм. Объем среды в колбах 150 мл.

Посевной материал выращивают в течение

18 — 20 ч на качалке (200 — 300 об/мин) при

28 — 30 С. Титр клеток в посевном материале достигает 1 — 3 10 кл/мл. Для засева ферментационной среды посевной материал добавляют в количестве 3 — 5 об. .

Ферментационная среда имеет следующий состав, г/л:

Меласса

480758

4 (1000 об/мин) ti аэрации. Количество подаваемого воздуха составляет 1 объем на 1 объем среды в 1 мин.

После 65 — 72 ч в культуральной жидкости накапливается 9,5 г/л 1 -триптофана, который выделяют известным способом с помощью ионного обмена.

Пример 2. Штамм-продуцент, выращивание посевного материала то же, что в примере 1. Отличие состоит в составе ферментационной среды и условиях ферментации. .Ферментационная среда содержит, г/л:

Гидрол 100,0 (по содержанию глюкозы)

Кукурузный экстракт 10,0 (по сухому весу)

КН Р04 0,6

К2НРО4 1,4

MgSO4 7 Н20 1,0

NaC1 0,5

Мочевина 5,0

Ферментацию проводят методом глубинного культивирования в колбах Эрленмейера (емкость 250 мл с двумя отбойниками), содержащих 30 мл среды, на качалке (200 — 220 об/мин) при 30" С.

Через 72 ч в культуральной жидкости содержится 8,2 г/л 1 -триптофана.

Пример 3. Штамм-продуцент, выращиЗ0 ванне посевного материала, как в примере 1, условия ферментации, как в примере 2. Ферментационная среда содержит, г/л:

Гидрол 150,0 (по сахару)

Кукурузный экстракт 15,0 (по сухому весу)

КН2Р04 0,6

К2НРО4 1,4

Мдьо4 7н о 1,0

40 NaC1 0,5

Мочевина 7,5

Через 72 ч в культуральной жидкости содержится 10,1 г/л I -триптофана.

45 Пример 4. Штамм-продуцент, выращивание посевного материала, как в примере 2.

Отличие в составе ферментационной среды.

Ферментационная среда содержит, г/л:

Мел асса 100,0

50 (по сахару)

Кукурузный экстракт 10,0 (по сухому весу)

КН Р04 0,6

К НРО4 1,4

MgSO4 ° 7Н О 1,0

NaC1 0,5

Мочевина 5,0

Через 72 ч в культуральной жидкости содержится 8,2 г/л I -триптофана.

60 Пример 5. Штамм-продуцент, выратцивание посевного материала, состав ферментационной среды, как в примере 4, но в качестве источника углерода добавлен сахар (100,0 г/л).

65 Выход 1 -триптофана составляет 4,6 г/л.

480758

Составитель В. Якубина

Текред Т. Миронова

Корректор О. Тюрина

Редактор Л. Тюрина

Заказ 3124!2 Изд. М 1676 Тираж 529 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, 5К-35, Раушская наб,, д, 4j5

Типографии, пр. Сапупова, 2

П р и м с р 6. Штамм-продуцент Bacillus

subtilis Ген-2282. Выращивание посевного материала, состав ферментационной среды, условия ферментации, как в примере 3.

Через 72 ч в культуральной жидкости содержится 7,8 г/л 1-триптофана.

Пример 7. Штамм-продуцент Bacillus

subtilis Ген-2282. Выращивание посевного материала, состав ферментационной среды, условия ферментации, как в примере 4.

Через 72 ч выход 1-триптофана составляет

6,7 г/л.

Предмет изобретения

Способ получения L-триптофана путем глубинного выращивания продуцирующнх его бактерий Bacillus suhtilis, не нуждающихся при синтезе 1 -триптофана в предшественнике, на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода — мелассу, гидрол, пищевой сахар, в качестве источника азота — мочевину, кукурузный экстракт, а также необходимые минеральные соли с последующим выделением L-триптофана из культур альной жидкости, о тл ич аю щи йся тем, что, с целью увеличения выхода 1 -триптофана, из микроорганнзов Bacillus subtilis используют штаммы Генетика-2282 и/или Генетика-3557, при этом источник углерода вводят в среду в количестве 150,0 — 100,0 г/л (по сахару), а источник азота — в количестве 15,0 — 10,0 г/л (по сухому весу).