Способ получения -галактозидазы

Способ получения -галактозидазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1 .4

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСИУ » 48075

Союз Советских

Социвлистических

Республик (61) Зависимое от авт. свид-ва— (22) Заявлено 19.12.72 (21) 1858199/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (51) М,Кл. С 12d 13/10

Гасударственный комитет

Савета Министраа СССР аа делам изабретеннй и открытий (23) Приоритет—

Опубликовано 15.08.75. (53) УДК 577.15 .08 (088.8) Бюллетень № 30

Дата опубликования описания 30.09.7G (72) Авторы изобретения Р. В. Фениксова, А. С. Тихомирова, Н. А, Загустина и Л. К. Куликова (71) Заявитель

Институт биохимии им. А. Н. Баха (54) СПОСОБ ПОЛ У 1 Е Н ИЯ р-ГЛЛ Л КТОЗ ИДЛЗ Ы

Изобретение относится к области биохимической промышленности, в частности к способам получения Р-галактозидазы.

Известен способ получения р-галактозидазы путем культивирования плесневых грибов пя водной питательной среде.

С целью повышения активности Р-галактозидязы по предлагаемому способу из плесневых грибов используют грибы рода Culvularia.

Из рода Curvularia используют вид inaequalis, а из вида Curvularia inaequalis используют ш та м м 7.

Пример. В качестве продуцента р-галактозидазы используют плесневый гриб Curvularia inaequalis, который выращивают на среде следующего состава, г/л;

Соевая мука 10 — 50

Лимонная кислота 5 — 30 (МН4) $04 1 — 5

NagHPO4 2 — 20

Мд$0 0,1 — 0,5

КСl 0,1 — 1,0 при рН 2,0 — 6,0.

Эта среда обеспечивает высокий уровень биосинтеза Р-галактозидазы, на биосинтез особенно влияет начальная величина рН среды.

При культивировании на такой среде этого гриба выход фермента в 2 — 2,5 раза боль2 ше, чем при выращивании А1(егпаг1я. 95—

98% Р-Галактозидазы переходит в культу ральную жидкость, что наблюдается только на среде этого состава и значительно облегчает дальнейшее выделение препарата р-галяктозидазы.

При добавлении в данную среду 2 — 10% гялактозы образование фермента увеличивается па 20 — 30%. Сухой порошок ферментного

10 препарата -галактозидазы получается при последующем осаждении культуральной жидкости органическими растворителями. Актив ность препарата, определяемая по о-нитрофенил-р-Д-галактопиранозиду, равна 800 ед/г, )5 удельная активность — 3,0 ед/1 мг белка, а при определении по лактозе 550,0 ед/1 г, удельная активность равна 2,0 ед/мг белка.

3а единицу актив ности Р-галактозидазы принимается такое количество фермента, ко20 торое за 1 мин при 30 С и рН 4,2 гидролизует

1 мкмоль о-нитрофенил-р-Д-галактопиранозида или лактозы.

Активность Р-галяктозидазы определяется колориметрически по появлению молекул

25 о-нитрофснола, освобождающегося под действием фермента из бесцветного о-нитрофенил+Д-талактопиранозида при рН 4,2.

При гидролизе лактозы глюкозооксидазпым методом определяется глюкоза.

30 Оптимум рН для действия 8-галактозида480759

sc4 данного прод цента раьеu 4,2 — 4,6. При р11 3,0 плп прп рН 6,0 сохраняется 70 /о активности. Фермептный препарат обладает высокой стабильностью в отличие от дрожжевой (>-галактозндазы. Гlри выдержива пии в растворах при рl-1 2,0 — 8,0 в течение 24 час активность "îõðàíÿåòñÿ на 100 /о.

Р-Галактозидаза используется для гидролиза лактозы молочных продуктов до глюкозы и галактозы. Прп гидролизе слаборастворимый, несладкий, пе сбраживающийся хлеОопекарными дрожжами, иногда не усваива1ощпйся животным организмом, дисахарид-лактоза превращается в растворимую, более сладкую, сбраживаемую, усваивающуюся смесь мопосахаридов. На этом основано практическое применение р-галактозидазы в хлебопече нп, медицине, ветеринарии, кондитерской промышлеп41ости, животноводстве и в

rex отраслях пищевой промышленности, которые связаны с утилизацией побочных продуктов переработки молока и с консервированием молока.

Ниже приводятся примеры культи вировапия гриба Curvularia inaequalis-продуцента

j - гал актозидазы.

Посевным материалом служит суточная культура грибов, выращенная при 28 С на

Hraðèçoâàníoé среде следующего состава, г/л:

Кукурузный экстракт, мл 3 — 10

Л актоза 10 — 50

ХН4КОз 1 — 10

Na НРО4 0,1 — 1,0

МО$О, 0,1 — 1,0

КС1 0,1 — 1,0 при рН 5,0 — 8,0

Дальнейшее глубинное культивирование гриба проводят в течение 2 — 5 суток при 28 С

/ па средах следующего состава, r л:

Среда № 1 — оптимальная для биосинтеза р-галактозидазы.

Соевая мука 10 — 50

Лимонная кислота 5 — 30 (NH4) gS04 1 — 5

Na НРО4 2 — 20

Мд$О, 0,1 — 0,5

КСI 0,1 — 1,0 при рН 2,0 — 6,0.

Мицелий отделяют от культур альной ж цдкости.

В культуральную жидкость переходит до

98% всего синтезирован ного фермента. Препарат фермента получается осаждением органическими растворителями. Активность препарата (по о-нитрофенил-р-Д-галактопиранозиду) равна 800 ед/г, удельная активность—

3,0 ед/мг белка.

При определении активности с лактозой в качестве субстрата — 550 ед на r, удельная активность 2,0 ед на мг белка.

Среда № 2. В среду № 1 добавляют 2—

10 г/л галактозы, при этом выход фермента увеличивается на 20 — 30 /о по сравнению со средой № 1.

Среда М 3 — сппттпческа

Лактоза (ЧН4) г$О4

KI-1gPO.1

Мд$04

КС1 при рН

Выход Р-галактозидазы 12 ральной жидкости и 8 единиц

10 цел ни. я.

15 00

2,00

13,60

0,15

0,50

4,6. ед/1 л культуостается в миСреда ¹ 4.

Кукурузный экстракт, мл 10

Лактоза, г 30

ы1-1411 О, 3

К НР04 1

Мд$04 7Н О 05

КСI 0,5 ,при рН 4,1 — 4,3.

Выход р-галактозидазы равен 92 ед/л среды и 36 единиц остается в мицелии.

Физиолого-биохимические признаки Curvularia inequalis относятся к порядку 1oni2в

liales семейству Dematiaceae. Гриб отнесен к виду Curvularia inaequalis.

Синонимы: Helminthosporium inaequalis

Snear. Bull. Tom. Club. 34, 307, 1907 Brachycladium ramosum Bainier. Bull. Trimestr. Soc.

М1со1. France 24, 80, 1908 Curvularia, ramosa

Bacdijn — Bull Sardian Botan. Buitenzord.

Ser. III. 13, 129, 1933.

В культуре споры имеют размеры (24)—

28 — 40 — (60) (10) — 11 — 16 — (18) мкм, большей частью с четырьмя перегородками, изредка с тремя или пятью, споры изогнуты, концы спор округлые, конидиеносцы коричневые, септированные, простые или иногда разветвленные, коленчатые на концах, различные

4 по длине, 4 — 6 мкм в диаметре. Отношение длины споры к ширине постоянно и ра вно

2,4; 2,3 и 2,5.

Культурально-морфологическая характеристика на 10 сутки роста.

45 На синтетической среде Чапека с сахарозой и ХaNOЗ. Колонии диаметром 50 — 70 мм, с неровным краем, округлые, зональные от оливково-серых по краю до темно-оливковых к центру.

Воздушный мицелий серый, войлочный.

Обратная сторона колоиий коричнево-,красная. Пигмента нет.

На сусло-агаре (сусло по Баллингу 5 ).

Колонии диаметром 50 — 100 мм с ровным

5; краем, округлые, выпуклые с бугристой поверхностью.

Воздушный мицелий обильный, бархатистый, сначала белый, затем серо-оливковый.

Обратная сторона колонии бурая. Пигмента

60 нет.

На среде с кукурузным экстрактом и лактозой колонии диаметром 70 — 80 мм с неровными краями, серо-оливковые, к центру темно-оливковые, округлые, плоские, зональ60 ность слабо выражена. Воздушный мицелий

480759

Составитель Т. Субботина

Техред Т. Миронова

1 орректор E. Рожкова

Редактор В. Блохина

Заказ 3597 Изд. Хо 1753 Тираж 529 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 5Ê-35, Раушская наб., д. 4/5

МОТ, Загорский филиал

5 прижатый, шерстистый, серый. Обратная сторона колонии бесцветная.

Физиолого-биохимические признаки.

Гриб синтезирует р-raëàêòîçèäàçó, внвертазу, протеазу, р-глюкозидазу, следы и-амилазы. Отношение к источнику углерода: растет на лактозе, глюкозе, сахарозе, мальтозе, потребляет азот в аммонийной и нитратной форме.

Прсдмет изобретения

1. Способ получения р-галактозидазы путем культивирования плесневых грибов на

6 водной питательной среде, отлича(ощай ся тем, что, с целью повышения активности

1З-галактозидазы, из плесневых грибов используют грибы рода Curvularia.

2. Способ по п. 1, отлича>ощай ся тем, что из рода Curvularia используют вид inaequalis.

Ip 3. Способ по пп. 1 и 2, отлича ощий ся тем, что из вида Curvularia irIaequails иопользуют штамм 7.