Способ получения целлюлазы

Способ получения целлюлазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

(!!) 482494

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Зависимое от авт. свидетельства (22) Заявлено 22.08.73 (21) 1959978/28-13 с присоединением заявки № (51) М. Кл. С 12d 13/10

Государственный комитет (32) Приоритет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 30.08,75. Бюллетень ¹ 32

Дата опубликования описания 04.01.76 (53) УДК 577.15.08 (088.8) (72) Авторы изобретения Л. С. Лосякова, Р. В. Фениксова, О. П. Кожемякина, T. И. Кудряшова, 3. Н. Мишина, H. А, Тиунова, H. А. Родионова и И. С. Коршунов

Всесоюзный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗЫ

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышленности и может быть использовано в сельском хозяйстве при силосовании грубых кормов, а также для получения сахаристых растворов из отходов пищевой и деревообрабатывающей промышленности, Известен способ получения целлюлазы путем культивирования грибов, относящихся к виду Trichoderma lignorum, поверхностным способом на питательной среде, содержащей пшеничные отруби и свекловичный жом.

Однако с помощью известного способа получают недостаточно активную целлюлазу.

С целью устранения указанного недостатка по предлагаемому способу для получения целлюлазы используют штамм 6С-24, а в питательную среду дополнительно вводят солодовые ростки при следующем соотношении компонентов, %:

Пшеничные отруби 55 — 60

Свекловичный жом 20 — 25

Солодовые ростки 25 — 15

Культура гриба Tr. lignorum 6С-24 выделена из гниющей бумаги путем рассева на питательных средах.

Культурально-морфологическая характеристика культуры гриба Trichoderma lignorum

6С-24 на 4-е сутки культивирования при

28 C

На синтетической среде Чапека с сахарозой колонии распростертые, достигают краев чашки Петри диаметром 9 см. Вначале развивается стерильный мицелий, бесцветный. На

3-и сутки по краю колонии (ширина 1,5 см) появляется конидиальное спороношение, окрашенное в темно-зеленый цвет. Обратная сторона колонии не окрашена, пигмента нет.

На сусло-агаре (сусло 5 по Баллингу) ко10 лонии распростертые, с более развитым мицелием, достигают краев чашки Петри. На

3-и сутки появляется конидиальное спороношение, доходящее до центра, колонии темнозеленого цвета. Обратная сторона колонии

15 желтовато-бурого цвета, есть пигмент.

На среде состава, %: фильтровальная бумага (измельченная) 1,00, (NH4) 2$04 — 0,15, NaNOg — 0,15, KNgPO4 — 0,05, 10%-ный экстракт из пшеничных отрубей, 300 (мл), вода

2О водопроводная до 14 л, — колонии распростертые, достигают краев чашки Петри, мицелий хорошо развитый, паутинистый. Конидиальное спороношение появляется на 3-и сутки. Колонии темно-зеленого цвета по всей

25 поверхности.

Обратная сторона колонии не окрашена. пигмента нет.

Морфологическая характеристика культуры гриба Trichoderma lignorum бС-24 на всех

30 средах сходна.

482494

3

Конидиеносцы в виде боковых ответвлений воздушного мицелия, большей частью вильчато или тройчато разветвленные, бесцветные. Фиалиды бутылевидные или конусовидные, слегка изогнутые, расположенные часто одиночно или мутовчато по 2 — 3 штуки размером 6 †)(2,5 — 4,5 мкм. Конидии шаровидные овальные 2,5 3,5 — 4,0 мкм в диаметре, зеленые, скученные в шаровидные головки.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Культуру гриба Trichoderma lignorum бС24 выращивают на питательной среде следующего состава, / . .пшеничные отруби 55 — 60, свекловичный ком 20 — 25, солодовые ростки

25 — 15. Среду увлажняют водопроводной водой до вла кности 60 — 65 /, стерилизуют при

0,8 — 1 ати 1 час, охлаждают до 35 — 38 С и производят засев споровой суспензии 4 — 5дневной культуры. Продолжительность выращивания 50 — 64 час при температуре 25—

32 С.

Активность культуры по осахариванию фильтровальной бумаги (С -фермент) 70—

80 ед/г, по разжижению натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (С„.-фермент) 40—

60 ед/г абсолютно сухой культуры.

Ферментный экстракт из культуры получают при соотношении абсолютно сухой культуры и воды 1: 3,5 — 1: 4.

Препарат целлюлазы выделяют из ферментных экстрактов одним из известных способов, используя органические растворитсли (этиловый или изопропиловый спирт, ацетон) или высаливанием. Осадок отделяют центрифугированием при 3000 — 4500 об/мин. Полученный препарат высушивают, например, лиофильно.

Выход препарата составляет 4 — 6 по весу культуры с активностью С1-фермента — 600—

700 ед/г, С-фермента — 450 — 600 ед/г.

Пример 1 (контроль). 20 г пшеничных отрубей, 20 r свекловичного жома смешивают и увлажняют водопроводной водой до влажности 60 /, Увлажненную питательную среду помещают в колбу емкостью 500 см и стерилизуют в течение часа при 1 ати. Затем охлаждают до температуры 38 С и засевают споровой суспензией 5-дневной культуры гриба Tn choderma lignorum 6С-24.

Засеянную питательную среду помещают в кювету (толщина слоя 2,5 см). Продолжительность выращивания 60 час при 30 С.

Активность С,-фермента — 23 ед/г абсолютно сухой культуры.

Активность С>-фермента в готовой культуре — 29 ед/г.

Готовую культуру измельчают водой в количестве 350 / (по абсолютно сухому весу).

Экстракцию проводят 1 час при 30 С. Затем производят отжатие биошрота до влажности

60"- . Фильтрат центрифугируют при 6000 об/

/мин и используют для получения препарата.

4

Выделение препарата целлюлазы проводят этиловым спиртом при крепости в смеси 72 .

Полученный осадок отделяют центрифугированием нри 4о00 oo/мин.

Активность С>-фермента в лиофильно высушенном препарате 282 ед/г, активность С,фермента — 226 ед/г.

Пример 2. 20 г пшеничных отрубей, 20 г свекловичного жома смешивают и увлажняют водопроводной водой до влажности 60 /ц.

Увлажненную питательную среду помешают в колбу емкостью 500 см и стерилизуют в течение часа при 1 ати. Затем охлаждают до температуры 38 С и засевают споровой суспензией 5-дневной культуры гриба Trichoderma lignorum 6С-24.

Засеянную питательную среду помещают в кювету (толщина слоя 2,5 см) . Продолжительность выращивания — 60 час при 30 С.

Активность С -фермента в готовой культуре — 43,5 ед/г, активность С-фермента—

34,5 ед/г абсолютно сухой культуры.

Готовую культуру измельчают, заливают водой в количестве 350 / (по абсолютно сухому весу). Экстракцию проводят 1 час при

30 С. Затем производят отжатие биошрота до влажности 60 / . Фильт рат центрифугируют при 6000 об/мин и используют для получения препарата.

Выделение препарата проводят этиловым спиртом при крепости в смеси 72 . Полученный осадок отделяют центрифугированием

4500 об/мин.

Активность С1-фермента в лиофильно высушенном препарате 420 ед/г, активность С.,— фермента — 340 ед/г.

Таким образом, предлагаемый способ получения целлюлазы с культуры гриба Trichoderma lignorum 6С-24, выращиваемой на питательной среде, содержащей, кроме пшеничных отрубей и свекловичного жома, солодовые ростки, позволяет повысить активность фермента в 1,5 раза.

П р и м ер 3. 22 г пшеничных отруоей, 10 r свекловичного жома и 8 г солодовых ростков смешивают и увлажняют водопроводной водой до влажности 60 / .

Увлажненную питательную среду помещают в колбу емкостью 500 см и стерилизуют в течение часа при 1 ати. Затем охлаждают до температуры 38 С и засевают споровой суспензией 5-дневной культуры гриба Trichoderma lignorum 6С-24.

Засеянную питательную среду помещают в кювету (толщина слоя 2,5 см). Продолжительность выращивания — 60 час при 30 С, Активность С>-фермента в готовой культуре — 76 ед/г, активность С„-фермента — 60 ед/

/г абсолютно сухой культуры.

Готовую культуру измельчают, заливают водой в количестве 350 / (по абсолютно сухому весу). Экстракцию п роводят 1 час при 30 С.

Затем производят отжатие биошрота до влажности 60 /ц. Фильтрат центрифугируют при

482494

Составитель Л. Лосякова

Редактор H. Спиридонова

Корректор Н. Аук

Техред 3. Тараненко

Заказ 3051!15 Изд. Мз 1751 Тираж 529 Подписное

Ц1-1ИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, )К-35, Раушская наб., д. 4 5

Типография, пр. Сапунова, 2

6000 об/мин и используют для получения препарата.

Выделение препарата целлюлазы проводят этиловым спиртом при крепости в смеси 72 .

Полученный осадок отделяют центрифугированием при 45000 об/мин.

Активность С>-фермента в лиофильно высушенном препарате — 700 ед/г, активность

С-ф ер м ент а — 585 ед/г.

Таким образом, культивирование нового продукта на предлагаемой среде позволило повысить активность фермента в 2,5 раза.

Культура гриба Trichoderma ligrlorum 6С24, выращенная по предлагаемому способу, может быть использована непосредственно, без выделения ферментного препарата, в сельском хозяйстве для силосования грубых кормов.

При действии целлюлазы на силосуемые растения увеличивается содержание редуцирующих сахаров в 5 — 10 раз. Добавление целлюлазы при силосовании кормов ускоряет процесс созревания силоса и сокращает потери питательных веществ.

Предмет изобретения

Способ получения целлюлазы путем культивирования грибов, относящихся к виду

Trichoderma lignorum, поверхностным способом на питательной среде, содержащей пшеничные отруби и свекловичный жом, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью получения более активной целлюлазы из грибов вида

Trichoderma lignorum, используют штамм

15 6С-24, а в питательную среду дополнительно вводят солодовые ростки при следующем соотношении компонентов, %.

Пшеничные отруби 55 — 60

Свекловичный жом 20 — 25

20 Солодовые ростки 25 — 15.