Способ получения иммобилизованных ферментов

Способ получения иммобилизованных ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

484250

СПИСАНИЕ

Союз Советскми

Соцмапистическмх

РЕС1тУбПИК

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 27,12.73 (21) 1980567/28-13 с присоединение» заявки ¹â€” (23) Приорптст—

Опубликовано 15,09.75 r. Бюллетень ¹ 34

Дата опубликования описания 22.03,76

1

J t

° Ф (51) М, Кл. С 12d 13/10

С 07g 7/00

Государственный комитет

Совета Министров СССР ао делам изобретений и открытий (53) УД1 577.15.08 (088.8) (72) Авторы изобретения В. Б. Толстогузов, Е. Е. Браудо, Е. С. Вайнерман, А. В, Максименко и 3. А. Стрельцова (71) Заявитель Ордена Ленина институт элементорганических соединений АН СССР (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ

ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к микробиологической, медицинской и пищевой промышленности, в частности к области получения иммобилизованных ферментов.

Известен способ получения .иммобилизованных ферментов путем смешивания их растворов с веществами, образующими гель, в качестве которых используют полиапионы, с последующим отделением образующегося осадка гель-фермента и его промывкой. ОдHако фермент, и»мобилизованный таким образом, недостаточно прочно закрепляется в геле и может вымываться в процессе использования.

Для получения более стабильных ферментов предлагается наряду с полианионами в качестве вещества, образующего гель, вводить раствор поликатиона.

В качестве полианионов используют синтетические и природные поликислоты, например кислые полисахариды или полиамфолиты, при рН выше их изоэлектрической точки, такие как альгинат натрия, пектин, каррагинан, гепарин, полиакриловая кислота, полигалактуроновая кислота, декстрансульфат натрия. В качестве поликатионов используют синтетические и природные полиоснования или полиамфолиты, например белки, при рН ниже их изоэлектрической точки, такие как полилизин, альбумин, эдестин, четвертичные аммониевые

2 или пиридиниевые основания (производные полистирола), алкилированный аминоэфир полиметакриловой кислоты.

Для наиболее полной иммобилизации в

5 гель исходного количества фермента компоненты геля берут в соотношении, соответствующе» максимальному количеству образующегося геля. Для этого получают зависимость оптической плотности смеси, образующейся

10 при смешивании растворов поликатионов и полиапиопов, в одном из которых растворен фермент, от состава смеси. Состав смеси, имеющий максимальную оптическую плотность, обеспечивает получение максимального

15 количеств а геля.

Образующийся при смешивании растворов поликатиона и полианиона осадок, содержащий фермент, отделяют от насадочного раствора декантацией или, для получения более

20 плотного геля, центрифугированием, промывают дистиллированной водой и оставляют на срок не менее 24 ч под слоем дистиллированной воды. По истечении этого периода образуется ферментативно активный гель, сохра25 няющий свою активность в течение нескольких месяцев. Гель можно хранить в высушенном виде. При последующем набухании его активность полностью сохраняется. Иммобилизованный в геле фермент действует на низ30 комолекулярные и высокомолекулярные суб484250

l0

Зо

3 раты, при этом его действие мало зависит от степени дпсперспости геля.

П р и м ер 1. Приготавливают 10 - вес. /о раствора альгината натрия и алкилированного аминоэфира полиметакриловой кислоты. В последнем растворяют трипсин до содержания

10- вес. ./о. Получают зависимость от состава оптической плотности системы, образованной смешиванием различных объемов указанных растворов при рН 8,0 и 8 С. Наибольшая оптическая плотность системы соответствует соотношению смешиваемых объемов растворов альгината натрия и аминоэфира 31:73 (соответственно). Исходя из этого соотношения, к

62 мл 0,5 /о-ного раствора альгината натрия приливают по каплям при перемешивании

73 мл 1%-ного раствора алкилированного аминоэфира полиметакриловой кислоты, содержащего 1 вес. % трипсина.

Образующийся при сливании растворов осадок отделяют центрифугировапием. Надосадочный раствор не обладает ферментативной активностью. Осадок промывают дистиллированной водой и оставляют под слоем дистиллированной воды на 5 суток. Активность полученного иммобилизованного трипсина, измеренная по скорости гидролиза этилового эфира N-бензоил-L-аргинина, составляет 1 /о от активности такого же количества фермента в нативном состоянии. Фермент не вымывается дистиллированной водой и 0,1М раствором NaCL Активность препарата не меняется в течение пяти месяцев, Препарат используют как наполнитель колонки, через которую в течение двух суток пропускают

10 — - /о-ный раствор казеина. Эффективность колонки, определяемая по числу разорванных ферментом пептидных связей, в течение двух суток непрерывной работы не меняется.

П р имер 2, Как в примере 1, определяют оптимальное соотношение объемов растворов альгината натрия, содержащего и-химотрипсин, и аминоэфира полиметакриловой кислоты, соответствующее максимальной оптической плотности системы. Исходя из этого соотношения, к 20 мл 0,5 /о-ного раствора альгината натрия, содержащего 0,5 /о сх.-химотрипсина, прибавляют по каплям при перемешивании 25 мл 1 /о-ного раствора алкилированного аминоэфира полиметакриловой кислоты; рН растворов 8,0, температура 8,0 С. Образующийся при сливании растворов осадок промывают водой и оставляют под слоем дистиллированной воды на 5 суток. Активность полученного иммобилизованного и-химотрипсина, измеренная по скорости гидролиза этилового эфира N-ацетил-L-тирозина, составляет 15 /О

0т активности такого же количества фермента

D n0гпв «и сост«я пи. Активность сохраняе ся неизмененной в течение по меньшей мере пяти месяцев.

П р и м ер 3. Как в примере 1, определяют оптимальное соотношение объемов растворов альгипата натрия и желатипы, содержащей рибопуклеизу, соответствующее максимальной оптической плотности системы. Исходя из этого соотношения, к 2 мл 1 /О-ного раствора альгината натрия прибавляют по каплям при перемешивании 10 мл 0,8%-ного раствора желатины, содержащего 0,02 г рибонуклеизы; рН растворов 4,2, температура 40 С.

Образующийся осадок промывают водой и оставляют под слоем дистиллированной воды па 5 суток. Активность полученной иммобилизовапной рибопуклеизы, измеренная па спектрофотометре на длине волны 292 нм по скорости гидролиза цитидин-2,3-циклофосфата, составляет 1 /о or активности такого же количества фермента в нативном состоянии.

П р и м ер 4. К 1,6 мл 1 /о-ного раствора декстрансульфата натрия прибавляют по каплям при перемешивании 8,4 мл 0,5 /о-ного раствора альбумина, содержащего 0,5 /о рибонуклеизы. Полученный гель обладает рибонуклеизной активностью.

Предмет изобретения

1. Способ получения иммобилизованных ферментов путем смешивания их растворов с растворами вещества, образующего гель, в качестве которого используют полианионы, с последующим отделением образующейся дисперсии гель-фермента и его промывкой, отличающийся тем, что, с целью получения более стабильных ферментов, наряду с полианионами в качестве вещества, образующего гель, вводят раствор поликатиона.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве поликатионов используют полиоснования и белки.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности, образующийся гель-фермент после промывки выдерживают в среде с низкой ионной силой, например в дистиллированной воде в течение

5 суток.

4. Способ по пп. 1 — 3, отличающийся тем, что, с целью наиболее полного включения фермента в гель, смешивание растворов полианионов и поликатионов осуществляют в соотношении, соответствующем максимальной оптической плотности полученной дисперсии, определяемой экспериментальным путем,