Способ получения живой брюшнотифозной вакцины

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

((() 492094

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительный к патенту (5i) М. Кл. С 12k 5/00 (22) Заявлено 16.08.71 (21) 1694985/28-13 (23) Приоритет 29.04.71 (32) 6319/71 (31) (33) Швейцария

Опубликовано 15.11.75. Бюллетень № 42

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 615.371(088.8) Дата опубликования описания 17.02.76 (72) Автор изобретения

Иностранец

Рене Германиер (Швейцария) Иностранная фирма

«Швейцаришес Серум — унд импфинститут унд Институт цур

Экфоршунг дер инфекционскранкхайтен» (Швейцария) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОИ БРЮШНОТИФОЗНОЙ

ВАКЦИНЫ

Изобретение относится к области медицинской промышленности и касается получения новой вакцины.

Известен способ получения живой брюшнотифозной вакцины путем выращивания стрептомицин-зависимого штамма Salmonella typhi в питательной среде со стрептомицином, отделении культуры и лиофилизации в защитной среде. Однако известная вакцина обладает недостаточной иммуногенной активностью.

С целью получения высокоиммуногенной вакцины предлагают использовать в качестве вакционного штамма мутант Salmonella typhi, обладающий блоком у.ридинфосфатгалактоза4-эпимеразы и пониженной галактокиназHoé и галакто-1-фосфатуридилтрансферазной активностью.

Вакцина для предотвращения тифозных инфекций содержит живые, устойчивые эпимеразиоотрицательные мутанты вирулентных штаммов Salmonella typhi, являющихся эпимеразо-отрицательными мутантами Salmonella typhi, обладаюших блоком уридинфосфатгалактоза-4-эпимеразы и пониженной галактокиназной и галакто-1-фосфатуридилтрансферазной активностью.

Селекцию эпимеразо-отрицательных мутантов осуществляют таким образом, что культуру Salmonella typhi после мутангенной обработки заражают smooth специфическими фагами. Для этих фагов эпимеразо-отрицательные мутанты Salmonella typhi являются резистентными, в то время как нормальные, вирулентные smooth-бактерии лизируются этими фагами. Таким образом достигается предварительная селекция эпимеразо-отрицательных

rough-мутантов, что облегчает их изолирование. В качестве smooth-специфических фагов используют фагп типа FO-1.

Вакцину получают выращиванием селекционированных бактерий и их переработкой в вакцину, которая заключается в отделении бактерий от питательной среды и лиофилизации бактериальной суспензии в защитной среде.

Новая оральная тифозная вакцина из живых бактерий обладает высовой иммунизирующей активностью, малой вирулентностью и устойчивостью к реверсии в дикую форму.

Мышам подкожно вводят по 10 живых микробов нового полученного штамма для вакцины, который называется Ту $В.

Для сравнения другим мышам вводят 10 живых бактерий вирулентного штамма Ту 2и

492094

3 через 10 дней ту. же дозу 10 неактивированных путем часового нагревания до 58 С микробов того же штамма, как усилители.

Определение числа бактерий в печени и селезенке этих животных показали, что аттенюированные бактерии штамма вакцины были элиминированы полностью уже по истечении 20 дней, в то время как бактерии вирулентного штамма, несмотря на меньшую дозу даже по истечении 4 недель были налицо у мышей в концентрациях 10 — 10 .

Через 6 недель после прививки мышам внутрибрюшинно ввели 10 живых бактерий вирулентного штамма Ту 2. В этот момент все животные были свободны от вакцинных бактерий. Путем определения числа бактерий в печени и селезенке мышей наблюдают за развитием бактерий возбудителей.

Преимущества живой вакцины из эпимира30-отрицательных мутантов заключаются в том, что одной оральной дачей можно добиться надежного, черезвычайно сильного, специфического иммунитета против патогенных для человека Salmonella typhi.

Вирулентный штамм Salmonella typhi выращивают в 30 мл Brain Heart Infision (Difco) в качалочной колбе емкостью 100 мл при

37 С. По истечении 4 ч отделяют центрифугированием клетки бактерий и суспендируют их в физиологическом растворе хлористого натрия таким образом, чтобы суспензия содержала 10з организмов на 1 мл. Эту суспензию облучают УФ-светом до тех пор, пока не будет достигнуто 80 -ное умерщвление бактерий.

Клеткам бактерий затем повторно прививают свежую Brain Heart Infision (Difco) и их инкубируют при 37 С на качалке, Через 2 ч культуру заражают smooth-специфическими бактериофагами типа FC-1 (1 бактериофаг/10 клеток бактерий) и инкубируют еще в течение

3 ч. Такой обработкой лизируются все smoothбактерии и остаются только rough-бактерии, которые распределяют на агаровую питательную среду и инкубируют в течение 14 ч при

37 С. Образовавшиеся колонии затем реплицируют на эндо-агар, который вместо лактозы содержит 0,2 / галактозы. На этой питательной среде можно легко узнать эпимиразо-отрицательные мутанты благодаря их виду роста в колониях: эпимиразо-отрицательные мутанты в противоположность дикому типу не сбраживают галактозу, и они растут в типичных бесцветных, плоских колониях с узким внешним валом и вогнутым центром, состоящим из лизированных клеток. Изолируют 30 из вышеупомянутых колоний и из них те делеционные мутанты, которые и после мутагенпой обработки N-метил-N -нитро-N-нитрозогуанидином ((NG) не показывают реверсии.

Для этой цели изолированные мутанты выращивают на Brain Heart Infision, через 6 ч обрабатывают NG с тем, чтобы получить

99 / -ное умерщвление.

Оставшиеся в живых клетки после двухкРатного отделения центрифугированием и

4 промывки в Brain Heart Infision суспендируют, инкубируют на качалке при 37 С и по истечении 2 ч распределяют на свежую Brain

Heart Infision, к которой добавили 0,1 / галактозы.

Из-за дефекта в энзиме ИДР-галактоза-4эпимераза эпимеразо-отрицательные мутанты не в состоянии метаболизировать поглощенную галактозу. Происходит накопление галактоза-1-фосфата и ИДР-галактозы, вследствие чего по истечении 3 — 4 ч происходит полный лизис эпимеразо-отрицательных бактерий. 3ачем еще в течение 3 ч инкубируют культуру, что способствует возникновению редких ревертантов. Оставшиеся в живых бактерии распределяют на содержащий галактозу эндоагар и инкубируют в течение 14 ч при 37 С.

Ревертанты можно легко узнать на этой питательной среде в виде сбраживающих галактозу темно-красных колоний.

Окончательно селекционированный мутант выращивают в Brain Heart Infision на качалке при 37 С. По истечение 6 ч бактерии отделяют центр ифугировани ем в охлаждающей центрифуге без промывки в защитной среде, состоящей из 8 / сахарозы, 1,5 желатины и

5 /ю порошка из снятого молока, суспендированной в 1 мл этой суспензии из бактерий, лиофилизируют в ампулы емкостью 5 мл.

Лиоампулу полученного нового вакуумного штамма открывают и штамм выращивают на питательной среде из скошенного агара при 37 С. Бактерии получают с поверхности скошенной агарной культуры и их суспендируют в физиологическом растворе хлористого натрия. Эту суспензию из клеток прививают содержанию колбы Эрленмейера емкостью

1 л. Колба содержит 600 мл питательной среды, которую получают путем растворения

28 г казеингидролизата, 10 г дрожжевого экстракта и 2 г глюкозы в 1 л дистиллированной воды и значении рН 7,2, который получают посредством 1 н. раствора NaOH. Колбу Эрленмейера в течение 6 ч встряхивают при

37 С. Полученную бактериальну ю культуру распределяют на 25 л полученной среды.

Культуру инкубируют в течение 12 ч при

37 С, проветривая ее (5 л воздуха/мин). Рост предварительной культуры и главной культуры определяют нефелометрическим путем.

Культурными пробами определяют чистоту.

По истечении времени культивирования клетки бактерий отделяют центрифугированием в охлаждаемой центрифуге без промывки, суспендируют в 600 мл защитной среды и порциями по 1 мл лиофилизируют в 5 мл ампулы или в прокалываемые пузырьки. Применяют ее следующим образом: ампулы или прокалываемые бутылки открывают, содержание суспендируют в 3 — 5 мл холодной или тепловатой воды или молока и дают через рот.

Формула изобретения

Способ получения живой брюшнотифозной вакцины путем выращивания вирулентного

492094

Составитель С. Малютина

Редактор Л. Новожилова Техред Е. Подурушина Корректор T. Добровольская

Заказ 105/18 Изд. ¹ 1972 Тираж 529 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 7К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 штамма Salmonella typhi, отделения культуры и ее лиофилизации в защитной среде, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью получения высокоиммуногенной вакцины, используют в качестве вакцинного штамма мутант Salmoпе1! а typhi, обладающий блоком уридинфосфатгалактоза-4-эпимеразы и пониженной галактокиназной и галакто - 1 - фосфатуридилтрансферазной активностью.