Способ получения лимонной кислоты

Способ получения лимонной кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

1п1 493979

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительный к патенту (51) М. Кл. С 12d 1/04 (22) Заявлено 18,05.73 (21) 1923129/28-13 (23) Приоритет 19.05.72 (32) 23579/72 (31) (33) Великобритания

Опубликовано 30.11,75. Бюллетень № 44

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 661.734(088,8) Дата опубликования описания 19.02.76 (72) Авторы изобретения

Иностранцы енс Маккензи Мэлл и Джордж Фредерик Паркер (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения лимонной кислоты с использованием дрожжей.

Известен способ получения лимонной кислоты путем культивирования продуцирующих ее дрожжсй Candida lipolytica при постоянной аэрации в питательной среде, содержащей углеводороды в качестве источника углерода, источник азота и необходимые питательные вещества, с последующим выделением лимонной кислоты.

В известном способе процесс ферментации ведут в периодическом режиме.

С целью непрерывности процесса предложено осуществлять подачу в ферментационную среду углеводородов и независимо подачу необходимых питательных веществ и отвод среды со скоростью, обеспечивающей поддержание углеводородов в объеме среды на постоянном уровне преимущественно 5 — 20 вес. %, при этом рН среды поддерживать равным

2,2 — 4,0, преимущественно 3,2 — 3,5.

Из вида Candida lipolytica рекомендовано использовать штамм АТСС 20228. В качестве источника углерода желательно использовать углеводороды, представляющие смесь н-парафинов, содержащих от 9 до 19 атомов углерода в молекуле, а рН поддерживать в желаемом интервале, добавляя газообразный аммиак или его водный раствор.

В качестве источника азота можно исполь5 зовать различные соли аммония, мочевину, а также органические источники азота, такие, как аминокислоты и пептон. желательно в питательную среду добавлять витамины группы 8, особенно тиамип, 10 минеральные катионы и анионы (магний, калий, железо, цинк, медь, марганец, кобальт, фосфат, сульфат) .

В ферментационную среду также добавляют поверхностно-активные вещества для со15 хранения углеводородов в мелкодиспергированном состоянии и пеногасители. Температуру поддерживают в интервале 26 — 30 С.

Аэрирование ферментационной среды осуществляют путем продувания воздуха в коли20 честве 0 3 — 1,5 об. воздуха на 1 об. средь в мин.

Культуральную жидкость отделяют от клеток дрожжей и от остаточных углеводородов обычным способом, например центрифугиро25 ванием и/или фильтрованием, и лимонную кислоту выделяют также обычным способом, например осаждением в виде трикальций цитрата.

493979

30

Другие углеводороды

50 б

С 13 02

С 14 06

С 15 28

С 16 12,4

С 17 30,8

С 18 34 1

С 19 140

С 20 1,9

С 21 0,5 а

С(13 0 1

С 13 39

С 14 20,8

С 15 32,7

С 16 27,1

С 17 13,9

С 18 0,9

С) 18 0,0

Н-алканы

60

3

Обнаружено, что при работе по предложенному непрерывному способу образуются меньшие количества изолимонной кислоты по отношению к лимонной кислоте, чем в случае периодического процесса с использованием того же штамма микроорганизма.

Пример 1.

A. Начальная запусковая операция. Приготавливают жидкую среду, содержащую 5 r/ë

Bacto Casitone (торговый препарат, представляющий собой панкреатический гидролизат казеина, выпускаемый фирмой Difco Laboratories; Detroit, Michigan, USA) разливают ее по 600 мл в колбы объемом 2,8 л, в каждую колбу добавляют 45 мл (34,5 г) н-парафинов, содержащих от 14 до 16 атомов углерода, полученных от The continental Oil Company, Ncw lîãk, USA.

После стерилизации среды каждую колбу засевают смывом с косяка со штаммом Candida lipolytica 20228 и выращивают на качалке при 26 — 27 С в течение 48 час.

В ферментационную среду, содержащую

2,6 г/л кукурузного экстракта, 4,0 г/л сульфата аммония, 15 г/л мела и 200 мл/л (153 г/л) и-парафинов (С 4 — С ), добавляют 5% посевного материала.

Выращивание осуществляют в 2 л среды в течение 53 час при 26 — 28 C и продувании воздуха со скоростью 1,25 л/мин.

270 мл этого посевного материала добавляют к 5 л стерилизованной среды следующего состава: мочевина — 2,0 г/л; MgSO4 7Н О—

0,4 г/л; СаСОЗ вЂ” 6,0 г/л; КН РО4 — 0,75 г/л; тиамин, НС1 — 0,25 мг/л; Fe++ 0,15 мг/л;

Zn++ — 0,5 мг/л; Cu++ — 0,125 мг/л; Мп++—

0,01 мг/л, К этому питательному раствору добавляют 980 мл/л (750 г/л) н-парафинов (С 4 — С„).

Выращивание осуществляют в ферментере при 26 С, перемешивании мешалкой со скоростью 1400 об/мин и продувании воздухом со скоростью 3,0 л/мин.

В первые 24 час величину рН поддерживают равной 7,25, добавляя водный раствор аммиака. Затем по мере образования кислоты рН снижают до 3,5 и далее поддерживают на этом уровне, добавляя водный раствор аммиака.

Б. Непрерывный способ. После 71 час в ферментер начинают непрерывно подавать среду со скоростью порядка 2 л в день (1,4 мл/мин) следующего состава: 0,4 г/л

MgSO4.7Í O; 0,75 г/л КН РО4, 0,25 мг/л тиамина, НС1; 0,6 мл/л НС! Fe++ — 0,3 мг/л;

Zn++ — 1,0 мг/л; Cu++ — 0,25 мг/л и Mn++—

0,02 мг/л. Од повременно вводят те же самые н-парафины (С 4 — С б) со скоростью 353 мл (270 г/сутки или 0,25 мл/мин).

Со скоростью 2 мл/сутки добавляют пеногаситель Ucon LB-625.

Скорость подачи воздуха увеличивают до

3,5 л/мин, температуру поддерживают равной

26 С и рН вЂ” равным 3,5 с добавлением водного раствора аммиака.

Объем среды увеличивают приблизительно до 7 л и, когда достигают этого уровня, среде дают возможность перетекать в приемник.

Продукт, который собирают в приемнике, ежедневно анализируют, оттитровывая образцы щелочью, чтобы определить свободную кислоту, а также после добавления формальдегида, чтобы определить кислоту, которая нейтрализована аммиаком.

Кроме того, пробы из приемника центрифугируют и прозрачную жидкость анализируют подобным способом для определения содержания кислоты, а также отдельно на содержание лимонной кислоты с использованием пентабромацетона и на соотношение лимонной и изолимонной кислот методом газожидкостной хроматографии.

После того, как общее время синтеза составит 304 час (71 час начальная пусковая операция и 233 часа непрерывный способ работы), количество синтезированной лимонной кислоты равняется 4,248 кг (считая на моногидрат) при общем весе введенных н-парафинов 3,337 кг, что дает общий выход 127%.

Доля лимонной кислоты составляет 92% от общего количества лимонной и изолимонной кислот. Углеводороды, использованные в примере 1, имеют следующий состав, вес. %:

Нормальные алканы С(14 0,0

С 14 84

С 15 64,9

С 16 21,5

С 17 4,5

С 18 0,7

С 18 0,2

0,2

Пример ы 2 и 3. Повторяют процесс, описанный в примере 1, но используют сначала (а) углеводороды, состоящие из нормальных парафинов, содержащих от 14 до 17 атомов углерода, которые получены от British Petrolешп Company Limited, of London, England, а затем (б) нормальные парафины с содержанием углеродных атомов от 16 до 19, которые получены от Техасо Inc., Petrochemical

Depаrtment, of New-Jork, USA.

Получены сходные результаты.

Эти углеводороды имеют следующие составы, вес. %:

Другие углеводороды 0,6 2,7

В каждом из указанных выше примеров величину рН среды во время непрерывного

493979

Предмет изобретения

Таблица 1

Выход лимонной кислоты

Пример рН

Немного меньше, чем при рН 3,5

Такой, как при рН 3,5

То же

2,8

3,0

3,2

4,0

Меньше, чем при рН 3,5

Таблица 2

Скорость наработки лимонной кислотой

Температура, С

Пример

Медленнее, чем при 26 С

То же

22

24

28

9

11

Такая же, как при 26 C

То же

Составитель Л. Минаева

Техред Е. Подурушина

Редактор А. Купрякова

Корректор И. Позияковская

Заказ !37/20 Изд. № 2039 Тираж 559 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 7К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 процесса поддерживают равной 3,5, а температуру среды 26 С.

Пример ы 4 — 7. Повторяют процесс, описанный в примере 1, но величину рН среды в течсние непрерывного процесса поддерживают равной величинам, указанным в табл. 1.

Пример ы 8 — 11. Повторяют процесс, как в примере 1, но температуру среды поддерживают в течение непрерывного процесса такой, как указано в табл. 2.

1. Способ получения лимонной кислоты путем культивирования продуцирующих ее дрожжей Candida lipolytica при постоянной аэрации в питательной среде, содержащей углеводороды в качестве источника углерода, источник азота и необходимые питательные вещества, с последующим выделением лимон10 ной кислоты, отличающийся тем, что, с целью обеспечения непрерывности процесса, осуществляют подачу в ферментационную среду углеводородов и независимо подачу необходимых питательных веществ и отвод среды

15 со скоростью, обеспечивающей поддержание углеводородов в объеме среды на постоянном уровне, преимущественно 5 — 20 вес. о о, при этом рН среды поддерживают равным 2,2—

4,0, преимущественно 3,2 — 3,5.

20 2. Способ по п. 1, отлич ающийся тем, что из вида Candida lipolytica используют штамм ATCC 20 228.

3, Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве источника углерода ис25 пользуют углеводороды, представляющие смесь н-парафинов, содержащих от 9 до 19 атомов углерода в молекуле.

4. Способ по пп. 1 — 3, отличающийся тем, что рН поддерживают в желаемом ин30 тервале, добавляя газообразный аммиак или

его водный раствор.