Способ выделения ферментов из растворов

Способ выделения ферментов из растворов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

7»» 1 ",1 »7 К (. И » . ОИ

».М:. »

».»И», »;,> . »„1о. 1» »»..>i »

I »¹953¹7

Союз Советских

Социалистических

Респ облик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Доно.пнитсльнос K HII I . свид-в» (22) Заявлено 30.07.73 (21) 1952818/28-13 (51) II. Кл, С 12d 13/10

С 07@ 7/00 с присоединением заявки ¹â€”

Гасударственный коиитет

Совета Мииистров СССР по делам изоеретеиий

И 071IPbITH > (23) Приоритст ——

Опубликовано 15.12.75. Бюллетень ¹ 46

Дата опубликования описания 01.12.76 (53) УДК 577.15.08 (088.8) (72) Автор изобретения

К. А. Калунянц, М. С. Ваганова, Г. В. Шусь, Т. В. Чугунова и Л. И. Стрельникова (71) Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ ИЗ РАСТВОРОВ

Изобретение относится к ферментной промышленности, а именно к способам Выделения фермснтных препаратов микробного происхо кдения и может быть использовано для получения очищен II Ix препаратов, например протеазы, целлюлазы, амилазы и др.

Известен способ выделения ферментов из растворов, например из фильтрата кульгуральной жидкости, предусматривающий концентрирование растворов, например, вакуумвыпариванисм, добавлснис в копцсптрат солей, например сульфата аммония, и отдсленис ооразовавшсгося осадка. По нзвсстному способу выход фермента сравнитсльllo низкий, Ie превышающий 70%, С целью повышения выхода ферментов и сокращения расхода осаждающих рсагенгов предлагают после добавления солей вводить в смесь флотагент, декантировать, удалять жидкую фазу и добавлять органический растворитель, предварительно охлажденный и имеющий значение рН, равное изоэлектричсской точке выделяемого фермента.

Целесообразно в качсствс флотагента использовать >кидкис парафины, которые вводят в количество 0,1 — 1% от объема смеси, а органический растворитель вводят в количестве

1 — 2 об. на 1 об. смеси.

Целесообразно также псрсд добавлением флотагента смесь охлаждать и рН устанавливать равным изоэлсктрнчсской точке выделяемого 1рсрмснта.

По предлагаемому способу получение»> IIIщеш1ых ферментов осуществляют двумя путя5

I способ. Микробный продуцент выращивают на питательной среде, содержащей пстошаки углерода, азота, витамины, стимуляторы роста и минеральные соли. По окончании про1о цссса ферментации биомассу отделяют, а фильтрат концентрируют в вакууме до содсржания сухих веществ 25 — 30%;. Затем в концентрат добавляют в качсствс улучшитслсй структуры осадка минеральные соли СаС1о и

15 NaCI в количествах соответственно 0,2 и 2,0 вес, % . .После растворения солей концентрат культуральной жидкости охлаждают до

1 — 3 С, доводят рН в нем до 5,0 — 8,0 путем добавления кислоты или щелочи, Органический

20 растворитель (этиловый, изопропиловый спирт) охлаждают до температуры от 0 до — 1 С, доводят рН в нем до 5,0 — 8,0 и смешивают с концентратом культуральной жидкости в соотношении 3:1. Далее ферментный осадок от25 деляют одним из известных способов и высушивают.

II способ. Микробный продуцент выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, витамины, стимуляторы

Зо роста, минеральные соли. По окончании про495347 цссса фермеитации биомассу отделяют, а фильтрат концентрируют в вакууме до содержания сухих вещест1в 30 — 35%, затем в концентрат добавляют сульфат аммония в ко.чичестве 40 — 50О/О. Смесь перемешивают, охла?к- 5 дают до 7 — 9 С и регулируют рН смеси в пределах 5,0 — 8,5. Затем добавля1от флотагеит (?кидкие парафины) в количестве 0,1% к обьему. Осадок фермента флотирует в течение

3 — 6 ч, а затем маточный раствор сульфата 10 аммония в количестве 0,8 — 0,9 об. сливают.

Оставшийся флотироваииый осадок перемешивают, к нему добавляют 1,5 — 2 об. органического растворителя (этплового, изопропилоного спи)эта или ацетона) и отделяют осадок !5 сепарпроваиием; флотагеит удаляется из фермеитиого осадка вместе с органическим растворителем. Сырой фермептцый осадок высушивают одним из известных способов.

Маточный )эаствор сульфата аммония утили- 20 зпруют.

Пример l. Получение очищенного препарата нейтральной протсазы.

Контроль.

Продуцспт Вас. subtilis-mesentei.ic выращивают па жидкой питательной срслс слслующсго состава, %:

Картофельный крахмал 8

Кукурузный экстракт 0,8

Макиий1 сериокислый 01 Зо

Дрожжи пивпыс 0,4

Кальций хлористый 0,1

Двузамсщсипый фосфат аммония 0,9

Вода ло 1.1

Культивирование проводят при 37 С, 1)осто- З5 янном псрсмешивации и аэрации в тсчсиис

48 и. По 01

6 л аммиачпоп воды 25%;-иой концентрации, 30 кг фильтропсрлита и 10 кг хлористого каль- 40 ция. Смесь тщательно перемешивают и скоягулироваипую биомассу отделяют Ild фильтрпрсссс. Получают фильтрат культуральпои

iliH)lI

60 сд./мл (метод Лсйляп-Фольгарда). Для вы- 40 деления препарата фермента к 1 м" фильтрата к) льтуральной жидкости (солержанис сухих п«ществ 5%) при +1 C и постоянном псрсмсипваппи ло1>ягляют 3 мз этилового спирта крепостью 96, охлажденного до -,-5 С и р)-1 Г)0 полученной смеси 6,0. Смесь выдср?кгп)а)от

10 )IHII и цсптрифугируют, осадок высупшвают. Прп таком способе выделения выход фсрмситя составляет 60%, по отиошс)шю к я)тив)гости кулыуральпой жидкости.

5,>

Расчет выхола фермсцтпого препарата с ! мз культуряльпой ?кидкости и расхода этилового спирт 1 па 1 кг препарата.

Лктивцость 1 мз культуряльцой ?кидкостп

А=6)0.10" ед. ПС.

Лктивпость готового продукта П=-600 c;I/г.

Выход препарата К=0,6. Тогда весовой выход препарата В составит:

Л- К 00-10" 0.0

13 == — -(--r — -- — - 0 I О,, 00;;..

Прп этом расход этаиола па осаждеиие 1 кг препарата составит:

300 л:60=50 л.

П р и м с р 2. Получение очищенного прспарата исйтра.чьиой протеазы по предлагаемому способу.

Процудецт Вас. subtilis-mesenlericIIs выращивают иа жидкой питательной среде следующего состава, %:

Картофсльпыи крахмал 8

Кукурузный экстракт 0,8

Магний серцокислый 0,1

Дрожжи пивпыс 0,4

Кальций хлорпстый 0,1

Двузамещеиный фосфат аммония 0,9

Вода до 1 л

Культивирование проводят при 37 С, постоянном псремсшпвапии и аэрации в течение

48 ч.

По окончании фсрмситации па каждый

1 M культуралы10й жидкости дооавляют 6 л аммиачной воды 25%-пой коццситрации, 30 кг фильтроперлита и 10 кг хлористого кальция.

Смесь тщательно перемешивают и скоагулироваппую биомассу отделяют па фильтр-прессе.

Получают фильтрат культуральпой жидкости с

llpoTcoëèTè÷ñcêoé активностью 60 ед/мл (метод

Лейл?п)-Фольгарда), которь)й используют для получеиия препарата нейтральной протеазы.

1 м фильтрата культуральиой жидкости с содержанием сухих веществ 5% коицецтриру1от в вакууме при 28 — 30 С в 2 раза, при этом концентрация сухих вс)цсств в концентрате достигаст 10%, а об)ъсм фильтрата уменьшается до 500 л. К 500 л концентрата добавляют 1 кг

СяС12 и 10 кг хлористого натрия, после растворения со.чей концентрат охлаждают до +1 С.

Для об)еспсчеп1111 более 11олиого осаждения ферментов этиловый спирт )юдщслячивают

25%-пым аммиаком до рН=7,5, затем его охлаждают Io температуры +5 С. К 500 л ох.чя:кдспиого концентрата llpll постояппом пс1)с.;1ешпгяпии добавляют 1500 л охла?кдс)шого щелочного спирта, смесь выдерживают 10 мип и цснтрифугируют, осадок высушивают.

При таком способе выделения выход фсрмсита составляет 80/p по отношсишо к активIl()cTI1 культурял ьной жидкости.

Расчет выхода с!)срмсптиого препарата с

1 мэ культуряльпой жидкости и расхода этилового спирта па 1 кг препарата.

Лктивность 1 мз культуряльпой жидкости

Л=60 ° 10" ел. ПС.

Активность готового продукта П=600 ел/г.

Выход препарата К= — 0.80, тогда весовой выхо;1, препарата «В» составит:

Л К 0Î.!О" 0.К и "00 iO" что ия 30% выли«. чем в коитролс. При этом расход этяцола пя осаждснис 1 кг прс)ьярата составит: 1500:80=20 л, что в 2,5 разя мепьшс. ч«м и коптр1).чс.

П р и м с р 3. Получение очищенного прспяpHia нейтральной протеазы. Контроль.

П!эолуцс)и Вяс. sl)htilis-гпе сп1с iclis пыра495347 щиьают на жидкой питательной средс следующего состава, о/о ..

Картофельный крахмал 8

Кукурузный экстракт 0,8

Магний сериокислый О,!

Дрожжи пивные 0,4

Кальций хлористый 0,!

Двузамегценный фосфат аммония 0,9

Вода до!л

Культивирование проводят при 37 С, постоянном персмсшивании и аэрации в течсиие

48 <1. ПО Окон ч31!Ии фермснтации па 1(аждый кубометр культуральиой жидкости добавляют

6 л аммначнон годы 25О/о-иой концентрации, 30 KI фильтроперлпта и 10 кг хлористого кальция. Смесь тщательно перемешивают и скоагу, IHðîB3ííóIo биомассу отделяют на фильтр-прессе. Получают фильтрат культуральной жидкосТН с протсолитичсской активностью 60 c„l/ì ( (метод Лсйлян-Фольгарда). Для выделения препарата фермента к 1 мз фильтрата культуральной жидкости (содержание сухих веществ 5О/о) при +15 С и постоянном исрсмсшиванин добавляют 500 кг сульфата аммония.

После растворения соли смесь оставляют B покос ня 6 ч. Затем выпавший осадок отделяют фильтрованием и высушивают. При таком способе выделения выход фермента составляет нс более?Оо/о по отношсни(о к активности «ультуря,дьной жидкости.

1 асчст выхода фсрмснтного препарата с 1м

«ультуряльной жидкости It расхода сульфата аммония иа 1 кг препарата.

Лкт!!вность ма культуральной жидкости ))=60.10(> ед ПС

Активность готового продукта П=-600 сд/г.

Выход прснярлта К=0,7. 1 огда весовой выхол нрспярлта «В» составит: . ) - К 60. ) 0" 0.7 () 600 )О

При 3 1 o. >f р Ibg)»T»» x()(OH I ((3 Ito I > ч>с((не 1 ((г lipcl!»p»l fl состаг>н (".

505:70=7,1 кг.

П р н м с р 4. Получсш!е Очищснпогo нрс!(»рата нсйтряльпой нротсязы но предлагаемому сnoc0()ó.

Продуцснт Вас. «п!)!(1(: -ьпеэеп)спсп» вырап(нгл!от на жидкой питательной среде следуtoщс 0 со("(я,а, О/), Картофельный крахмал 8,0

Кукурузный экстракт 0,8

Магний сернокислый 0,1 (РОЖ>КИ ПИВН1>IС 0,4

Кя..п,ций хлористый 0,1 .!вуза:>(си(снн! !1! фосфат аммония 0,9

Воля ..10 1,(! ху,lt>THBIlp0(l»nl((. I(p()f)0ляТ lip((37 С, ИОСТОя:(ном перс)(енп(в<лни(! II аэрации в течение

<18 >I

П 0 О к О н ч 3 н и н > () с р м с n T 3 I t i I n l (<1 «а ж л ы Й 1 м к<> л!>т<> i)».п>ИОй жн (1 Ости:to()IIB,!я!От 6 л 3)l)IH лчной во:I ы 25О/о -пой «о((цс нтрацнн, 30 к! (1)н„.!ьтрîn(ð<(èò» и 10 кг ..(лÎрнстого кальция.

Смесь тщ:.те,п,но нсремешнва!от и скоаг),5(нi)0!)3(:.(Ис!() бl(ом асс 01. I c я ют па g)I(, tbTp-прсссс.

Получают фнльтрат культуральиой жидкости с протсолитической активностью 60 сд/мл (метод

Лейлин-фольгарда), который пспользу!От для нолучсш!я препарата нейтральной протсазы.

1м фильтрата культуральной жидкости с содержанием сухих веществ 5О/о, концентрируют в вакууме нри 28 — 30 С, доводя содержание сухих rctgccTB в концентрате до 30 — 35О/о, а ооъсм до 150 — 200 л. Затем к 200 л концентря10 та добавляют нри постоянном нерсмешиваиии

80 кг сульфата аммония. Смесь охлаждают до

8 — -10 С и для лучшего выпадения фсрмснта в осадок рН смеси аммиачной водой доводят до значения 8,0 — 8,5. Затем добавляют 200 мл

15 жидких парафинов и осадок флотпруют в течение 6 1. По окончании флотацни освствлспный маточный раствор сульфата аммония в количестве 180 — 200 л (9/10 00.) сливают. Ферментиый осадок суспендируют г, ocT»BLlllixc

20 20 л н смешивают с 30 — 40 л этилового или изопропилового спирта. Полученную смесь сспарируют, при этом флотагеит удаляется из фсрмснтиого осадка вместе со спиртом. Отделенный фермснтный осадок высушивают.

При таком способе выделения выход фермента составляет 90О/О по отношсшпо к активности культураlbnoll жидкости.

Расчет -выхода фермсптного препарата с

1 м" культуральной жидкости и расхода сульфата аммония на 1 кг пре(!Ярата.

Л (стн Вн ость 1 м 1(")л ьт р 3<л ы1 о Й жидкости

А=60 10" ел. ПС.

Активность готового продукта П=600 сл/г.

Выход препарата К=0,9

Тог>(я гссовой Bbtxo,j препарата «В» сост»вит;

Л )С 60.10" 0,((Г, —... - г) --боо )-о=.- — =-90;:. I fO ИЯ 28 / B1>1(BC «ОИТрОЛ51.

-I0 Прп этом p»cxoд сульфата 3)(мония ил получение «г готового продукта составит:

80:90=0,9 кг, что в 8 рлз мспьш(. чем в «онтролс.

4:) П р и м с р 5. ) !07(ученнс очищенного преп;)рлтл цсллюлязы (контрогп>), Продуцент цсллюлазы Тпс1)ос)е!И)я и!пс)с выра!цивают на I(1!T»tcльной среде слслующс.гÎ

СОСТЯВЯ. /() .

50 Свекловичный >ком о

Сх <(b(t) »T >! .>(он!! 5!

Однозл. >1е(цснн1>11! (1)осфорно« I l C.1 Ьl н 1(л;I H n 0.2

Ку<а>ьтивнровяиис проводят ((pl! но Tonl(t(0%(66) нсрсмсшивании II аэряпии в Tc÷ñínc 6 суток нрн тем licpатурс 28 — -30 С. По О«ончании 1 ульTHB1lp0B31l115I б!!О .>(<(се > ОтлелЯIОт (j)li.lüTp»öèc!(, л фн..п трат смешивают с 50% сульфата лммо1(ия. После растворения соли выдег!Ивн!Ийся

60 фермеi(T отделяют фильтрацией и Bысушнвл(от в вя«уумс.

По данному clioco()v выход препарата 0-. ставляст 42О/о к исходной активности культурлльпой жидкости.

6> Рлс icT выходя фсрмсптного tip(.пар»та с 1ма

495347

Предмет изобретения

Составитель Г. Шусь

Редактср Н, Новожилова Тсхрсд Т, Курилко

Корректор P. Юсипова

Заказ 2001 Изд. № 1073 Тираж 529 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )1(-35, Раушская наб., д. 4/5

Обл. тип. Костромского управления издательств, полиграфии и книжной торговли культуральпой жидкости и расхода сульфата аммония на 1 кг препарата.

Акти зпост1> 1xl ку.10T) !>алиной

А=1 ° 10 ед. С.

Актнвйость готового продукта П = 120 сд./г.С.

Выход препарата !х=0,42.

Тогда весовой выход препарата составит:

Л К 1.10 0,42

120.103

При этом расход сульфата аммония iia получение 1 кг препарата составит:

500:3,5= 1- 13 кг.

П р и м с р 6. Иолучснис очищенного препарата цсллюлазы по предлагаемому способу.

Продуцент целлюлазы Trichodeima uiridc выращивают на питательной срсдс слсдующсго состава; % .

Свекловичный )ком 5

Сульфат аммония 1

Одпозамсщснпый фосфорно- 20 кислый калий 0,2

1(ультнвирование проводят,нри псстояпном персмешивании и аэрации в течение 6 суток и темпсратурс 28 — 30 С. По окончании культивирования биомассу отделяют фильтрацией. 25

Фильтрат концентрируют в вакууме при температуре 28 — 30 С до содержания сухих веществ

20%. При этом объем 1 м фильтрата уменьшается в 8 — 10 раз, т. с. копсчный объем концентрата составляет 100 л. Затем к 100 л кон- 30 цептрата прибавляют при постоянном псрсмсшивапии 50 кг сульфата аммония н 100 л жп.tzzx парафинов; осадок флотируют в течение

4 ч. По окончании флотации 90 л освстлcííого маточного раствора сливают, фсрмсптный осадок суспендируют в оставшихся 10л маточного раствора, смешивают с 20 л этплового нли изопропилового спирта. Полученную смесь сспарируют, при этом флотагснт удалястся из ферментного осадка вместе со спиртом. Отделен- 40 ный ферментный осадок высушивают. Выход фермента при таком способе выделения составит 85%.

Расчет выхода фсрментного препарата с 1 м культуральной жидкости и расхода сульфата,45 аммония на 1 кг препарата.

Активность 1 м культуральной жидкости

А=1,0 1Ов ед. С.

Активность готового продукта П =120 ед/г. С.

Выход прспарата К=0,85.

Тогда весовой выход препарата составит:

Л К 1,0 10 0,75

П 120 10

Прн этом расход сульфата аммония на получение 1 кг препарата составит:

50:7,1=7,00 кг, что I3 — 20 раз меньше, чем в контроле.

Прсдлагасмый способ позволяет повысить выход фсрмснтного препарата до 80 — 90%, значительно увсличить степень сто очистки и снизить расход этилового спирта на осаждсиие от 3 до 10 раз, расход сульфата аммония от 8 до 20 раз.

1. Способ выделения ферментов из растворов, например из фильтрата культуральной жидкости, предусматривающий копцснтрированис растворов, например вакуум-выпариваштсм, добавление в концентрат со IcH, например сульфата аммония, и отделение образовавшегося осадка, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода ферментов и сокращения расхода осаждающих рсагснтов, после добавления солей в смесь вводят флотагент, декантируют, удаляют жидкую фазу и добавляют органический растворитсль, предварительно охла)кдспный и имеющий значснис рН, равное изоэлсктричсской точке выделяемого фермента.

2. Способ ilo и. 1, отгггчающийся тем, что в качестве флотагснта используют )кидкие парафины.

3. Спосоо по и, и. 1 — 2, отличающийся тем, I To жидкис парафины вводят в количестве

0,1 — 1% от объема смеси.

4. Способ по и. п. 1 — 3, отличающийся тем, что органический растворитсль вводят в количестве 1 — 2 об. па 1 об. смеси.

5, Способ по и. п, 1 — 4,,отличающийся тем, что псред добавлением флотагснта смесь охлая<дают и рН устанавливают равным изоэлсктричсской точкс выделяемого фермента.