Способ электрофоретического разделения саркоплазматических и миофибриллярных белков скелетных мышц животных

Способ электрофоретического разделения саркоплазматических и миофибриллярных белков скелетных мышц животных

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Соватснин

Социалистичвскин

Уесвубпик (») 496И5 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 29.10,?3 (21) 1973206/28-13 (51) М. Кл. B 01к 5/00 с присоединением заявки № (23) Приоритет— (43) Опубликовано 25.12.75 Бюллетень № 47 (45) Дата опубликования описания 03 О3 7

Гасударственный квинтет

Соната Мнннстраа СССР пе делам нзаервтеннй н аткрытнй (щ уд 637,127.3(088.8) (72) Авторы изобретения

Е. В. I"óíàð и Г. 3. Якубов (71) Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский институт холодильной промышленности (54) СПОСОБ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ

И МИОФИБРИЛЛЯРНЫХ БЕЛКОВ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ЖИВОТНЫХ и- овцы.

Гель для разделения саркоплазматических ! и миофибриллярных белков готовят в соот; ветствии с методикой, приведенной ниже.

К 23 г частично гидролизованного крах мала добавляют 250 мл трис-боратного бу фера (90% смеси 0,0033 М лимонной кислоты и 0,016 М триса; 10% смеси 0,02М

Изобретение может быть широко применено при аналитических работах по оценке пищевой ценности продукта в мясной промышленности, а также в других отраслях промышленности при проведении исследовательских работ, Известен способ электрофоретического разделения белков скелетных мышц животных, например саркоплазматических и миофибриллярных, в крахмальном геле, предус10 матриваюший приготовление крахмального геля, его охлаждение и разделение белков методом электрофореза, Однако из-за недостаточного охлаждения 1а крахмального геля происходит резкое повы- шение температуры в процессе электрофоре за, в результате чего создаются условия, которые приводят к значительной денатура- ; ции саркоплазматических и миофибриллярных 20 белков при их.электрофоретическом разделе- .нии, что, естественно, искажает белковую картину исследуемого препарата.

Белью изобретения является предотвращение денатураций белков в крахмальном 25 геле в процессе их разделения и промерзания геля.

Это достигается тем, что электрофорез проводят в крахмальном геле при температуре преимущественно 22-26 С с одновременным охлаждением геля хладоносителем, например этиловым спиртом или фреоном30 при температуре от -5 до -55 С.

При этом разделение саркоплазматических белков в процессе электрофореза осу» шествляют при температуре хладочосителя от -5 до -25оС, миофибриллярных — от

-30 до -55OÑ.

Предлагаемый способ исследования белка мышечной ткани животных осуществлен в лаборатории биохимических исследований

ВНИХИ на скелетных мышцах быка, свиньи

496045

Охлаждение о льдом при 0 С

Применение хладоносителя с температурой

or -5 до -25OC

Охлажден ие о льдом при,О С

Применение хладоносителя с температурой от -30 до

-55

0,12

0,18

0,12

0,24

0,32

1,04

0,24

10,72

6,08

3,80

0,25

0,36

3,85

4,14

2,04

0,66

0,77

0,60

0,47

0,62

3,20

0,84

0,72

0,68

1,34

1,08

8,22

0 99

1,66, 3 гидрата окиси лития и 0,076 М борной кислоты; рН 8,5), содержащего 1 М моче вины (фракционирование саркоплаэматических белков); к 2 4,5 г крахмала добавляют

220 мл трио-боратного буфера, содержашэ-: > го 4 М; очевины (фракционирование миофибриллярных белков). Полученный гель за ливают в кювету иэ-плексигласа (270 х

xllO х 6 мм), толшина днища которого составляет 5 мм, 10

Для применения способа электрофоретического разделения белков скелетных мышц животных целесообразны и другие извесь ные буферные системы, Саркоплаэматические белки растворяют у в трис-боратном буфере, содержащем сахароэу, а миофибриглярные белки — в 8Ммочевине из расчета 3-4 мг на полоску хроматографической бумаги (3-10 мм), которую затем вставляют в гелевую пластину. 2Q

Разделение белков проводят при силе тока 25-30 ра, напряжения 800-1100в ,в течение 2,0-3,5 час.

Для обнаружения белков на протеинограмме гель выдерживают в растворе ниг- % розина.

Денситометрир ование протеинограмм проводят на микрофотометре МФ-4 с записью сигнала на автоматическом потенци метре ЭПП-09. ЗО

Для эффективного охлаждения крахмального геля по предлагаемому способу электрофореза в качестве хладоносителя применяют этиловый спирт или фреон — 30, хладагентом является смесь сухого льда и спир- @ та, загружаемая в малый котел ультратермостата. При этом хладоноситель поступает в охлаждаюший столик (270 х 11 0 х х 25 мм) из плексигласа, .охлаждающая по40

Саркоплазматические белки, см

4 верхность которого является одновременно дном кюветы, используемой для приготов,,ления крахмального геля. Необходимая теьl . пература крахмального геля (22 26оС и хладоноситела от -,5 до -25о и от -30 до

-55оС) для разделения соответственно сар коплазматических и миофибриллярных бел ков поддерживается ультратермостатом (например марки И-10 или И-8, ГДР).

Температуру крахмального геля в процессе электрофореза определяют хромелькопелевой термопарой с помощью потенциометра ПП-63 (класс 0,5) с внешним гальванометром М195/2.

Большое число и содержание отдельных белковых фракций как при разделении саркоплазматических белков, так и миофибрилляр, ных выявляется при использовании хладоносителя с .дифференцированной отрицательной температурой. Значительно меньшее количество и число белковых фракций выявляется при электрофорезе в крахмальном геле, охлаждаемом льдом.

Этот вывод подтверждается результата« ми денситометрирования протеинограмм, приведенными в таблице. Из нее следует, что сумма плошадей пиков саркоплазматических белков, разделенных при использсь вании хладоносителя с температурой от -5 до -25оС, превышает почти в 1,6 раз плошадь пиков, полученную при разделении белков с использованием льда. Еше большее различие наблюдается при разделении миофибриллярных белков. Так при использовании предложенного способа (температура хладоносителя от -30 до -55оС н температура крахмального геля 23о-26о) площадь пиков возрастает в 1,8 раз.

Мнофибрнллярные белки, см2

496045

2,50

2,60

0, 93

0,53

3,48

0,68

4,08

0,65

Итого 50,61

32, 75

18,19

81,98

Ф ормула из обретения

1. Способ электрофоретического разде пения саркоплазматических и миофибрилляр ных белков скелетных мышц животных в крахмальном геде, предусматриваюший при готовление крахмального геля, его охлаждение и разделение белков методом элек» трофореза, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью предотвращения тепловой денатурации белков в крахмальном геле a оро-, цессе их разделения и промерзания геля, ® электрофорез проводят в крахмальном геле при температуре преимушественно 22-26оС ) Составитель МЛарина 1 екред И.Карандашова Корректор Т,Гревцова

Редактор д,яер

Заказ ф тираж

Изд. М 1Щ/

Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, 113035, Раушская наб., 4

Предприятие «Патент», Москва, Г-59, Бережковская наб., 24

2,25

5,46

3,88

2,20

2,73

5,27

1,34

1,26

5,6Р

1,38

1,00

1,30

8,05

0,75

0,84

0,12

0,20

0,12

0,24

4,13

Р,26

718О

2,98

2,14

8,47

2,52 .

1,82

8,97

1,78

1,42

2,13

13,30 ,0,90

0,99

0,16

0,16

0,24

0,24

0,17

0,16 с одновременным охлаждением геля хладоносителем, например этиловым спиртом или фреоном - 30 при температуре от -5 до

-55 С, 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю ш и йс я тем, что разделение саркоплазматиче ских белков в процессе электрофореза осушествляют при температуре хладоносителя от -5 до -25оС

3.Способпоп. 1, отличаюшийс я тем, что разделение миофибриллярных белков в процессе электрофореза проводят при температуре хладоносителя от -30 дл -55OC