Способ получения иммобилизованной полинуклеотидфосфорилазы
Иллюстрации
Показать всеРеферат
ОП ИСАНИ Ё
ИЗОБРЕТЕНИЯ ти1 4983l5
Союз Советских
Социалистических
Республик
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 23.01.74 (21) 1989378, 28-13 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет
Опубликовано 05.01.76. Бюллетень № 1
Дата опубликования описания 08.04.76 (51) М, K,ë. - С 07G 7/02
Государственный комитет
Совета Министров СССР (53) УДК 577.15.08 (088.8) по делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения (71) Заявители
В. П. Кумарев, А. С. Райт, В. К. Райт и В. В. Хомов
Новосибирский государственный университет и Специальное конструкторско-технологическое бюро биологических активных веществ (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ
ПОЛ И Н УКЛ ЕОТ ИДФО СФОР ИЛАЗЫ
Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, в частности к получению иммобилизованных ферментов.
Известен способ получения иммобилизованной полинуклеотидфосфорил азы путем ковалентного ее связывания с активированным водонерастворимым носителем.
Однако активность иммобилизованной по этому способу полинуклеотидфосфорилазы низкая и, кроме того, она не обладает необходимыми свойствами.
Для достижения указанной цели в качестве носителя используют силикагель, несущий активные остатки альдегида, присоединенные к носителю по связи кремний-углерод. Для стабилизации иммобилизованной таким образом полинуклеотидфосфорилазы ее обрабатывают восстанавливающим агентом, например боргидридом натрия в боратном буфере. Предварительно высокоочищенная иммобилизованная полинуклеотидфосфорилаза сохраняет
57 — 68о/о своей первоначальной активности, а ее использование в проточном колоночном варианте позволяет получить полинуклеотиды, не загрязненные примесями эндогенных нуклеиновых кислот.
Пример. 700 мг широкопористого микросферического силикагеля марки силохром
С-1, содержащего 34 мк экв/г активных остатков пропионового альдепида, заливают
0,1 М боратным буфером и подвергают тщательной дезаэрации под вакуумом. После это5 го силикагель загружают в колонку (5 К 0,6 см) и промывают боратным буфером. 4,5 мл раствора полинуклеотидфосфорилазы в боратном буфере (всего 69 мг белка) многократно пропускают через колонку
10 с силикагелем в течение 1,5 час при 4 — 6 С до прекращения изменения концентрации белка в растворе. Для удаления с поверхности силикагеля нековалентно связанного белка колонку промывают 0,5 М раствором NaCI
15 в боратном буфере и затем боратным буфером. Образовавшуюся между белком и альдегидными группами силикагеля связь стабилизируют восстановлением, пропустив через колонку 15 мл раствора боргидрида натрия
20 (1 мг/мл) в боратном буфере. После этого снликагель удаляют из колонки, промывают на стеклянном фильтре охлажденным боратным буфером, подвергают дезаэрации под вакуумом и вновь загружают в колонку для ис25 пользования пммобилизованной полинуклеотидфосфорилазы в реакции полимеризацпи рибонуклеозиддифо" фатов.
Количество белка, ковалентно связавшегося с силикагелем, рассчитывают по балансу
30 между исходным и несвязавшимся белком, 498315 рывного использования в реакции полимеризации (прн рН реакционной смеси 8,0) составляет 25 суток.
Формула изобретения
1. Способ получения иммобилизованной полинуклеотидфосфорилазы путем ковалентного ее связывания с активированным водонерастворимым носителем, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличения активности иммобилизованной полинуклеотидфосфорилазы и придания ей необходимых технологических свойств, в качестве носителя используют силикагель, несущий активные остатки альдегида, присоединенные к носителю по связи кремний-углерод.
2, Способ по п. 2, отличаю щи и ся тем, что, с целью стабилизации иммобилизованной полинуклеотидфосфорилазы, ее обрабатывают восстанавливьпощим агентом, например боргидридом натрия в боратном буфере.
Составитель С, Беляев
Техред 3. Тараненко
Корректор Л. Денискина
Редактор Е. Меньшова
Заказ 4!7/!3 Изд. У 178
ЦНИИПИ Государственного комитета по делам изобретений и
Москва, )К-35, Раушская
Типография, пр. Сапунова, 2 определенным по методу Лоури. Для определения активности инкубируют прн 37 С 1 мл реакционной смеси, содержащей в мк-моль:
АДФ 25; трис 100; Mg (CHзСОО) 2 10 (pH
8,0) и водорастворимую или иммобилизованную полинуклеотидфосфорилазу. За единицу активности принимают такое количество фермента в препарате, которое в вышеуказанных условиях за 10 мин катализирует превращение 1 мк моль АДФ в полимер. Таким образом, с 1 г силикагеля связывается ковалентно
41 — 51 мг белка (1,2 — 1,5 мг белка на мк-экв. альдегидных групп), содержащего бб—
120 единиц активности (1,9 — 3,5 единиц активности на мк.экв альдегидных групп). Иммобилизованная полинуклеотидфосфорилаза полностью сохраняет активность в течение месяца при 4 — б C. Период «полужизни» иммобилизованного фермента в процессе непреТираж 576 Подписное
Совета Министров СССР открытий наб., д. 4/5