Способ получения антибиотика

Способ получения антибиотика

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

фмйимотека. ИБ »

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

i») 501680

Союз Советских

Социалистических

Республик (б1) Дополнительный к патенту. (22) Заявлено 22.12.72 (21) 1870482/28-13 (23) Приоритет — (32) 23.12.71 (31) 211231 (33) США

Опубликовано 30.01.76. Бюллетень ¹ 4 (51) М, Кл."- С 120 9/14

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 615.779.931 (088.8) Дата опубликования описания 09.04.7б (72) Авторы изобрете »и

Иностранцы

Роберт Л. Хамилл и Марвин Мартин Хон (США) Иностранная фирма

«Эли Лилли энд Компани» (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

Изобретение относится к фармацевтической промышленности.

Предлагаемый способ получения антибиотика, не описанный в патентной и доступной специальной литературе, заключается в том, что культуру Streptomyces albus МКК! 3883 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащий источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта и разделением на активные компоненты известными приемами.

Новый антибиотик получают путем выращивания .нового штамма актиномицета в условиях культивирования микробов в глубине аэробной питательной среды.

Актиномицет, используемый при получении антибиотика, идентифицирован как штамм

Streptomyces albus (Козэ1 — Doria) Waksman u Henrici.

Микроорганизм депонирован Северным Отделом использования, исследования и развития, сельскохозяйственной исследовательской службой, сельскохозяйственным департаментом США, Пеория, Иллинойс. Его номер ARRL 3883. Штамм выделен из образцов почвы, собранной в Кюрасао (Dutch Antilles).

Для выделения штамма часть почвенных образцов суспендируют в стерильной деионизированной воде и суспензии высевают на питательной агар в чашках Петри. Затем их инкубируют при 25 — 35 С до тех пор, пока не достигнут роста, далее колонии микроор5 ганизмов, производящих антибиотик, переносят на косой агар стерильной платиновой петлей. Косой агар инкубируют, чтобы обеспечить необходимый прививочный материал для получения антибиотика.

Микроскопическое строение, характеристика культуры и физиология

Микроскопическое строение: спо рофоры

1g имеют спиральную форму, споры — овальную (1,00 — 1,25 0,50 — 1,00 мкм) и встречаются в виде цепей от 10 до 50.

Характеристика культуры: на питательной среде № 2 ра стет обильно. Субспратный ми2р целий светлый, желто- коричневый. Хороший воздушный мицелий и споруляция белого цвета.

Растворимый пигмент отсутствует.

На аитательной среде № 3 растет преКрас25 но. Субстратный мицелий белый, Воздушный мицелий очень хороший, наблюдается споруляция, белая с .разбросанными зонами светло-желто|го цвета.

501680

На питательной среде ¹ 4 растет обильно.

Субстратный,мицелий бледно-желтый. Обильный воздушный мицелий и белая споруляция. Светко-,коричневый лигмент отсутствует.

Яблочнокислый кальций. Рост хороший. 5

Субстратный мицелий светло-желтого цвета.

Воздушный мицелий умеренный и слоруляция бледно-желтого цвета. Растворимый пигмент до наличия светло-желтого цвета отсутствует. 10

Питательная среда Чапека. Рост хороший, субстратный мицелий светло-желтого цвета.

Воздушный мицелий бледно-желтого цвета, споруляция. Растворимый .пигмент отсутствует. 15

Томатная паста с овсяной му кой, Рост обильный. Субстратный мицелий бледножелтого цвета. Хороший, воздушный мицелий и с поруляция желтовато-серого цвета, Растворимый пигмент отсутствует. 20

Физиология

Хорошо растет и спо рулирует при 26—

37 С. Не растет л ри 43, 49 или 55 С. Снятое молоко не сверты вает, наблюдается поверх- 25 ностное кольцо роста. Желатин |разжижает полностью после 21 суток. Легкое восстановление нитратов после 21 суток.

Питательная среда может быть любой, однако предпочтительными являются среды, 30 которые содержат легко усвояемый источник углерода, такой как глюкоза, маннит, фруктоза, растворимый крахмал, декстрин, меласса, желтый сахар. В среду вводят источник азота, например, овсяную муку, мясной экс- 35 трат, гидролизированный казеин, замоченные зерна, дрожжевой экстракт, соевые бобы, пептоны (мясные или соевые).

В питательную среду могут быть включены минеральные соли, например, дающие 40 ионы калыция, магния, натрия, калия, .кобальта, хлора, сульфата или карбоната, и ростовые вещества, такие как дрожжи или дрожжевые экстракты.

В питательную среду добавляют также 45 микроэлементы.

Микроорганизм растет при температуре

26 — 40 С, предпочтительно между 26 — 30 С, рН питательной среды находится в пределах

6,5 — 7,2. Образование антибиотика происхо- 50 дит от двух до пяти дней.

Небольшие количества антибиотика получают в колоах, а поверхностную культуру— в бутылках. Для приготовления больших количеств антибиотика выращивают культуру 55 микробов в глубине аэробной питательной среды в больших резервуарах.

Чтобы избежать задержки в процессе производства антибиотика, используют вегетативную форму микроорганизма для посева в 60 питательной среде в производящих резервуарах. Вегетативный прививочный материал микроорганизма вначале приготавливают путем инокуляции, а затем асептически переносят его в резервуары для получения в боль- 65 ших количествах. Для производства прививочного материала вегетативной формы может быть использована та >ке питательная среда, что и для получения антибиотика.

Культуру микробов в глубине аэробной питательной среды продувают стерильным воздухом — 0,3 объема воздуха в 1 мин на 1 объем питательной среды.

Концентрацию активности антибиотика в питательной среде определяют во время ферментации путем тестирования образцов питательной среды на их подавляющую активность против роста известного микроорганизма.

При разделении и очищении антибиотика на активные компоненты А и В могут быть использованы различные методы, например, солевая экстракция, применение адсорбентов и колоночной хроматографии.

Активный компонент А, выделяемый из смеси антибиотика, представляет собой оелую, кристаллическую смешанную натрийкалиевую соль, имеющую точку плавления

161 †1 С.

Смешанная натрий-калиевая соль антибиотика не растворима в воде, слегка растворима в метаноле, растворима в простом эфире и в сложных эфирах, таких как метилацетат, этилацетат, в кетонах, таких как ацетон и метилэтилкетон, в хлороформе, бензоле и толуоле.

Компонент А стабилен в растворе при величине рН -4,0 и температуре до 27 С.

Свободная кислота компонента А представляет собой белое кристаллическое твердое вещество, плавящееся при 97 — 99 С. Элементарный состав этой кислоты следующий:

63,31 /о углерода, 8,83 водорода и 28,03 /о кислорода.

Масс-спектральные данные компонента А указывают на приблизительный вес 834. Молекулярный вес натриевой соли составляет

-874, поэтому молекулярный вес свободной кислоты равен -852.

Смешанная натрий-калиевая соль антибиотика компонента В представляет собой белое кристаллическое вещество, плавящееся при 170 — 172 C. Растворимость и стабильность компонента В аналогичны образцам смешанной натрий-калиевой соли компонента А. Кислотная форма компонента  — это белое кристаллическое твердое вещество с точкой плавления 122 — 124 С. Элементарный состав: 60,49 /о углерода, 9,15"/о водорода и

31,32 кислорода.

Молекулярный вес натриевой соли компонента В, вычисленный из данных по титрованию, составляет — 877. Молекулярный вес свободной кислоты компонента В равен — 855.

Новый антибиотик обладает ингибирующим действием н а рост микроорганизмов, как бактерий, так и грибков, патогенных для животных и растений, и полезен при подавлении роста таких микроорганизмов.

501680

При иапытании тестом дисков оба компонента антибиотика показали видимые зоны ннгпбирования против следующих микроорганизмов: Bacillus suhtilis, Mycobacterium avicem Sarcina lutea.

Компонент В при испытании в вирускультивируемой среде проявляет активность против вируса коровьей оспы, поливируса III, вируса комариной лихорадки Семлики, вируса герпеса и вируса гриппа Япония 305.

Антибиотик предотвращает развитие некоторых заболеваний растений, Препарат из смеси кзмпзнснтзз А и В при разбрызгивании -ффзктивен прзтив мучнистой росы бобовых пастений и кзрончатого галла помидоров. Гlрн прим,. нии на инфицированных растениях ":помощью разбрызгивания или смачивания указанная смесь активна и против вирусных заболеваний растений — вируса южной мозаики фасоли и вируса карликовости маиса.

Антибиотик обладает также инсектицидной активностью. Например, при контакте с растворами компонента А или компонента В антибиотика при концентрации 100 частей на тысячу, гибель домашних мух достигает 88 /а, при концентрации 250 частей на тысячу—

99%.

В ажным свойством антибиотика является его способность предотвращать развитие кокцидиоза у домашних птиц.

Антибиотик (и его компоненты) улучшает усвоение углеводоров у животных, т. е. повышает эффективность их вскармливания. Он влияет на состав свободных летучих жирных кислот в рубце, в частности увеличивает количество пропионата, доступного для обмена у жвачных.

Другим важным свойством антибиотика является способность образовывать комплексы с моновалентными катионами. В экспериментах по определению ионной специфичности компонент А показал специфичность к ионам калия и рубидия, в то время как сам антибиотик проявляет специфичность к ионам натрия и калия. Использование же ионноспецифичных электродов является важным во многих химических анализах, Пример 1. Ферментация методом встряхивания.

Культуру, производящую антибиотик, приготавливают и поддерживают на косом агаре, имеющем следующий состав (г):

Декстрин 700 10

N-Z амин А 2

Мясной экстракт 1

Дрожжевой экстракт 1

Атар 20

Деионизированная вода 1 (л).

Косой агар инокулируют антибиотикопроизводящей культурой ККК1 3883 и инкубируют при 30 С в течение 4 — 6 дней. Спорулированный косой агар покрывают небольшим количеством стерильной деионизированной воды и осторожно соскабливают, чтобы полу20

2,00

1,00

0,01

20,00

1 (л) Раствором едкого натра рН питательной среды доводят до 7. После стерилизации паром (путем автоклавирования) в течение

30 мин рН питательной среды составляет 6,9.

Косой агар инокулируют антибиотикопроизводящей культурой МКК1 3883 и инкубируют при 30 С в течение 10 дней. Спорулированный косой агар покрывают небольшим количеством стерильной деионизированной воды и осторожно скоблят для получения водной суспензин, содержащей споры, Каждую косую среду используют для инокуляции шести сосудов (объем 250 мм), в каждом из которых находится 50 мл стерильной вегетативной питательной среды следующего состава (г):

Глюкоза 15,0

Соевая крупа 15,0

®0 Замоченные зерна 10,0

N аС1 5,0

СаСОЗ 2,0

Водопроводная вода 1,1 (л).

Раствором едкого натра рН питательной среды доводят до 6,5, и она не изменяется чить водную суспензию, содержащую споры, 1 мл полученнзй спороносной суспензпи используют, чтобы инокулировать 100 мл стерильной вегетативной питательной среды, 5 имеющей следующий состав (г):

Глюкоза 15

Соевая мука 15

Замоченные твердые зерна 5

CaCOç 2

10 N аС1 5

Bo: oïðoâoäHàÿ вода 1 (л).

Инокулированную вегетативную питательную среду инкубируют 24 — 48 час при 30 С на обратном шейкере. Затем порцией (5 мл) полученной культуры инокулируют 100 мл произвздящей питательной среды, находящейся в сосуде Erlenmeyer (емкость 500 мл) и имеющей следующий состав (г):

Соевая мука 15

Казеин 1

NaNO 3

Сироп из глюкозы 20

Водопроводная вода 1 (1).

Инокулированную питательную среду оставляют для ферментирования на 42 — 72 час прн 25 — 30 C в ротационном шейкере (250 об/мин).

Пример 2. Резервуарная ферментация антибиотика.

З0 Культуру, производящую антибиотик, приготавливают и поддерживают на косом агаре, имеющем следующий сзстав (г);

Декстрин 10,00

Дрожжевой экстракт 1,00

Казеин, гидролизированный ферментами

Мясной экстракт

СаС! 6Н О

Агар

40 Деионизированная вода

501680

Составитель С. Малютина

Редактор Н. Спиридонова Текред T. Курилко Корректор М. Лейзерман

Заказ 668/15 Изд. № 1072 Тираж 551 Подписи

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, К-35, Раушская наб., д. 4, 5

Сапунова, 2

Типография, пр. при стерилизации (путем автоклавирования) в течение 30 мин.

Инокулированную питательную среду оставляют для ферментации на 72 час при 30 С на ротационном шейкере (250 об/мин). Порцию (10 мл) полученной культуры используют для инокуляции 200 мл стерильной питательной среды второй стадии роста, содержащейся в литровом сосуде и имеющей указанный выше состав.

Инокулированную питательную среду оставляют для ферментации на 30 час при 30 С на обратном шейкере (250 oo/мин). Порцией (200 мл) полученной культуры инокулируют

25 л питательной среды, находящейся в 40литровом ферментаторе и имеющей состав (%):

Глюкоза 2,50

Соевая крупа 1,50

Казеин, гидролизированный в кислой среде 0,10

Мел асса 0,30

СаСОз 0,25

Водопроводная вода 95,35

После стерилизации в автоклаве в течение 30 мин рН питательной среды составляет 7,2.

Инокулированную питательную среду насыщают воздухом (скорость 0,3 объема воздуха на 1 объем культуры в 1 мин) и перемешивают при помощи конвенционной мешалки (3 50 об/мин).

Фермснтацию проводят при 30 С е течение

5 дней.

Пр им е р 3. Изоляция антиДиотической смеси.

92 л ферментативного бульона, полученного при ферментации антибиотика, фильтруют при помощи мелкозернистого материала, образующ го фильтрующий слой. Лепешку мицелия с,спендируют в 25 л метанола, и смесь энергич1:о перемешивают 30 — 60 мин, фильтруют, фильтрат концентрируют, чтобы удалить метанол. Полученную таким путем водную среду смешивают с фильтратом первоначального ферментационного бульона.

Затем экстрагированную лепешку мицелия суспендпруют в 25 л этилацетата, и суспензию пе1.емешивают 30 — 60 мин. Смесь фильтруют и лепешку мицелия отбрасывают. Профильтрсванный бульон экстрагируют дважды половин зй объема этилацетата. Использованный бульон отбрасывают. Полученные этила5

40 цетатовые экстракты смешивают с этилацетатовым экстрактом лепешки мицелия.

Объединенные экстракты концентрируют до. получения маслянистого остатка, который растворяют в 1 л хлороформа. Раствор хлороформа пропускают через колонку питтсбургского угля, заполненного в хлороформе.

Колонку промывают 20 л хлороформа. Вытекающий хлороформ и промывку смешивают и концентрируют до сухого остатка.

Пример 4. Разделение антибиотика на активные компоненты А и В.

30 г сырой антибиотической смеси, полученной согласно описанному выше методу, растворяют в смеси бензола и этилацетата

9; 1. Раствор пропускают через колонку, заполненную силикагелем. Адсорбент предварительно промывают смесью бензола с этилацетатом (9: 1). Далее колонку промывают

6 л смеси бензола с этилацетатом (9: 1); вытекающую и промывную жидкость отбрасывают. Затем колонку элюируют смесью бензола с этилацетатом (4: 1). Элюат собирают в несколько фракций: компонент А выходит из колонки в первых фракциях, а компонент

 — собирается в последующих.

Идентификация антибиотика в отношении колоночных фракций определяется с помощью бумажной и тонкослойной хроматографии. Колоночные фракции, содержащие тот же антибиотик, смешивают и выпаривают в вакууме для получения соответствующих индивидуальных антибиотиков в достаточно чистой форме.

Активный компонент А кристаллизуют путем растворения аморфного антибиотика в теплом простом эфире. Антибиотик кристаллизуют как смешанную натрий-калиевую соль с точкой плавления 163 — 165 С. Выход 11,8 г.

Активный компонент В также кристаллизуют из эфира в форме смешанной натрий-калиевой соли с точкой плавления 170 — 172 С.

Выход 5,3 г.

Формул а изооретения

Способ получения антибиотика, о т л и чаю шийся тем, что культуру Streptomyces

a1bus ИКРАМ 3883 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта и разделением на активные компоненты известными приемами,