Способ получения калликреинтрипсин-ингибитора
Патент 503511
Авторы
Классы МПК
Способ получения калликреинтрипсин-ингибитора
Иллюстрации
Реферат
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
I пп 5035II
Союз Советских
Социалистических
Республик
Х ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (51) М. Кл.2С 07С 103 52 (22) Заявлено 31.03.72 (21) 1765857, 28-13 (23) Приоритет — (32) 03.04.71 (31) P 2116377.9 (33) ФРГ
Опубликовано 15.02.76. Бюллетень ¹ 6
Государственный комитет
Совета Министров СССР ро делам изобретений и цтхрытнК (53) УДК 615.779.94 (088.8) Дата опубликования описания 06.05.76 (72) Авторы изобретения
Иностранцы
Эрих Рауенбуш и Кристиан Гелькер (ФРГ) Иностранная фирма
«Байер АГ» (ФРГ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ
КАЛЛ ИКРЕИН-ТРИПСИН-ИНГИБИТОРА
Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к получению лекарственных препаратов.
Известен способ получения калликреинтрипсин-ингибитора, заключающийся в том, что органы крупного рогатого скота, например легкие, измельчают и после экстракции целевой продукт осаждают кислотами, например сульфосалициловой кислотой, с последующей кристаллизацией целевого продукта после его обессоли вания. Однако известный способ является трудоемким.
С целью упрощения процесса экстракт подкисляют до рН 1,0 —,3,0, вводят в него соли, например сульфат аммон|ия в концентрации ! †4 г/л, подвергают контакту с нейтральным нерастворимым в воде сшитым полимером пористой структуры из стирола и дивинилбензола с активной поверхностью 10—
1000 м /г, последовательно промывают полимер водой или разбавленной соляной кислотой и раствором соли этилендиаминотетрауксусной кислоты, элюируют целевой продукт градиентом воды и смешивающегося с водой органического растворителя.
Для осуществления способа существенным является качество сырого экстракта. Для этого орган, например легкое или околоушную слюнную железу, обрабатывают путем .метанольной экстракции и метанол затем снова полностью удаляют из экстракта. Сферическая активность составляет 70 — 90 единиц калликреин-ингибитора на 1 мг сухого веса.
Если переведение в растворимую форм осуществляют путем добавления карбоновой или минеральной кислоты, то после осветления адсорбция ингибитора на смоле является неполной, но ее можно улучшить посредст10 вом предварительной обработки сырого экстракта, например, путем добавления таких солей, как, например, сульфат аммония, или переведение в растворимую форму осуществля1от в присутствии сульфата аммония. Адсорб15 ция улучшается вследствие повышающейся концентрации соли, причем как верхний предел концентрация начинающегося осаждения ингибитора не должна быть превышена. Для сульфата аммония таким пределом является
20 насыщенность 0,2 — 0,5 при значении рН 1 — 2,5.
Свойство смолы также имеет большое значение, применяют пористые полимеризаторы из стирола и дивинилбензола с большой внут25 ренней поверхностью.
Адсорбцию ингибитора на смоле осуществляют из кислого раствора при значении рН
1 — 3. После проведенной адсорбции ингибптора смолу промывают волн м раствором.
503511
Наряду с чистой водой применяют и 0,01 М соляную кислоту и затем 0,02 М раствор натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты. При этом удаляют примеси. Вымывание ингибитора из смолы осуществляют органическими, смешиваемыми с водой раствори телями, например метанолом, этанолом, изопропанолом, ацетоном.
Концентрация, при которой вымывают калликреин-трипсин-ингибитор, зависит от вида растворителя. Добавки к растворителю могут изменить процесс десорбцин, Так, например, добавка аммиака содействует ускорению вымывания, причем вымываются и красящие компоненты. Полученный таким обра-ом калликреин-трипсин-ингибитор как показал электрофорез в полиакриламиде или на ацетилцеллюлозе, в значительной степени свободен от других сопутствующих полипептидов и солей. Специфическая активность составляет
3000 — 4000 единиц калликреин-ингибитора на
1 мг сухого веса. Выход составляет 60 — 80% содержания ингибитора сырого экстракта при обогащении в 30 — 40 раз.
Пример 1. 700 г легкого крупного рогатого скота, освобожденного от соединительной ткани и измельченного, переводят в растворимую форму метанолом при добавке хлорида кальция. Суспензию отдел я ют центрифугированием и в вакууме в ротационном испарителе сгущают до 275 мл. Метанол полностью удаляют. Значение рН раствора 1,5 устанавливают, добавляя 2 н. соляную кислоту, затем снова центрифугируют. Отделившийся сверху слой содержит 880000 единиц калликреин-ингибитора. Этот раствор вводят в следующую колонну.
50 г пористой полистирольной смолы с поверхностью 330 м /г поглощают в метаноле и до тех пор промывают, пока метанол не станет практически свободен от адсорбируемых при ультрафиолетовом облучении (280 HM) веществ. Затем метанол декантируют н заменяют кипяченой дистиллированной водой.
Водную суспензию смолы (примерно 100 мл), свободную от пузырей, вводят в стеклянную колонну и промывают 200 мл воды.
Содержащий ингибитор сырой экстракт вводят в колонну с пропускной скоростью
100 мл/ч, промывают 200 мл 0,01 М соляной кислоты и затем 200 мл натриевой соли 0,02 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 100 мл воды. Ингибитор при этом с линейным градиентом 1 л воды к 80% метанола вымывают и фракционированно улавливают. Содержащую ингибитор фракцию объединяют, метанол выпаривают в вакууме и водный раствор подвергают сублимационной сушке. Получают 180 мг ингибитора с 714 единицами калликреин-ингибитора, что составляет 81% содержания ингибитора. Специфическая активность составляет 3960 единиц калликреин-ингибитора на 1 мг.
Пример 2. 4 кг измельченного легкого крупного рогатого скота смешивают с 7,2 л
5 !
О
1 I3
5()
60 г дистиллированной воды. По истечении 10 мин размешивания добавляют 350 мл 10% -ной (по объему) HqS04 до установления значения рН 1,9. Дополняют до 12 л, дополняют 200 мл толуола и размешивают в течение ночи при комнатной температуре. Суспензию центрифугнруют в течение 10 мин при 4800 об/мин.
Общая активность в отстоявшемся наверху слое 8,15 !0 единиц калликреин-ингибитора.
Размешивая в течение 30 мин, добавляют (NIR<) SO> до насыщения 0,45. Значение рН посредством добавки концентрированной
IdqSO4 устанавливают на 1,5, в качестве фильтровального вспомогательного вещества добавляют 320 г кизельгура и немедленно фильтруют.
7 л этого раствора (общая активность
4,38)(10 единиц) калликреин-ингибитора вводят в колонну примерно с 2 л пористой полистирольной смолы с поверхностью
150 м /г. Перед этим кислоту промывают 1 н. метанольным HCI, метанолом и водой. После введения экстракта колонну промывают 4 л
0,01 и, НС1, 4 л 0,02 ЕДТА (натриевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты) и 2 л дистиллированной воды, затем вымывают линеарным градиентом, состояющим из 5 л дистиллированной воды и 5 л 80%-ного метанола. Активные фракции объединяют, метанол отгоняют в вакууме и раствор лиофилизируют. Получают 1,3 г вещества со специфической активностью 2500 единиц калликреин-ингибитора на 1 мг (общая активность
3,22)(10 единиц калликреин-ингибитора), что соответствует выходу 73,5% .
Пример 3. 120 кг легкого крупного рогатого скота метанолом при добавке хлорида кальция согласно примеру 1 переводят в растворимую форму. Из 400 л полученного прозрачного фильтрата метанол тщательно отгоняют. Водный раствор, содержащий калликреин-трипсин-ингибитор в сыром виде, подкисляют НС! до значения рН 1,5 и вводят в колонну с 8 л пористой полистирольной смолы с поверхностью 150 м /г. Общая активность
152)(10 единиц калликреин-ингнбитора. Колонну промывают 16 л 0,01 н. НС1, 16 л 0,02 М
ЕДТА и 10 л дистиллированной воды. Затем активное вещество вымывают линеарным градиентом из 20 л дистиллированной воды и
20 л 80%-ного метанола. Фракции, содержащие активное вещество, объединяют, метанол отгоняют и раствор лиофилизируют. Получают 25,7 г твердого вещества со специфической активностью 4200 единиц калликреин-ингибитора на 1 мг (общая активность 10 10 единиц калликреин-ингибитора), что соответствует выходу 71%.
П р и мер 4. 120 л легкого крупного рогатого скота, переведенного согласно примеру 1 с метанолом — хлоридом кальция в растворимую форму, после удаления метанола, установления значения рН 1,5 и центрифугирования дали 67 мл отделившегося сверху слоя с !
50000 единицами калликреин-ингибитора. В
503511
Составитель С. Малютина
Техред 3. Тараненко
Редактор Е. Хори на
Корректор О. Тюрина
Заказ 906jl3 Изд Хз 1116 Тираж 575 Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, К-35, Раушская наб., д. 4/5
Типография, пр, Сапунова, 2
5 этот сырой раствор ингибитора вводят 10 мл пористой полистирольной смолы. После
30 мин на нутч-фильтре смолу отсасывают и промывают 100 мл воды, Затем смолу суспендируют и в течение 30 мин размешивают в растворе 20 мл изопропанола, дополненного водой до 100 мл. Смолу отсасывают и в фильтрате после отгонки изопропанола в вакууме определяют ингибитор. Выход 123 единиц калликреин-ингибитора, что составляет 80% имевшегося содержания ингибитора.
Формула изобретения
Сгюсоб получения калликреин-трипсин-ингибитора путем селективного выделения из сырого экстракта органов крупного рогатого скота, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, экстракт подкисляют до рН 1 0 — 3 О, вводят в него соли, например
5 сульфат аммония, в концентрации 1 — 400 г/л, подвергают контакту с нейтральным нерастворимым в воде сшитым полимером пористой структуры из стирола и дивинилбензола с активной поверхностью 10 — 1000 мз/г, после10 довательно промывают полимер водой или разбавленной соляной кислотой и раствором соли этилендиаминотетрауксусной кислоты, элюируют целевой продукт градиентом воды и смешпвающегося с водой органического ра15 створителя.