Способ получения антибиотика
Патент 503531
Авторы
Классы МПК
Способ получения антибиотика
Иллюстрации
Реферат
О Л И С А Н И Е () 503531
ИЗОБРЕТЕН Ия
Союз Советских
Социалистических
Республик
К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту—
2 (51) М. Кл.
С 12 0 9/00 (22) Заявлено 12.03.73 (21) 1893231/15 (23) Приоритет — (32) 13.03.72
Гасударственный комитет
Совета Министров СССР оо делам иэооретений н открытий (31) 234347 (33) США (43) Опубликовано 15.02.76. Бюллетень № 6 (45) Дата опубликования оиисания18.07.77 (53) УДК
615.779.9:576 852 (72) Авторы изобретения
Иностранцы
Ладислав Джемс Ханка и Давид Гленн Мартин (ChlA) Иностранная фирма
"Те Упджон Кампэни" (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА
Изобретение относится к микробиологическим способам получения антибиотиков.
Предлагают способ получения антибиотика путем культивирования Streptomyces в аэробных условиях в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости и очисткой, С целью получения антибиотика, имеющего структуру
С1
Сп се з1
1 iO 11-I .Í-СО, Р)
NH3 используют Streptomyces Sviceus.
Фильтрат культуральной жидкости адсорби, >уют ионообменной смолой, и далее целевой продукт элюируют.
Оптстку целевого продукта производят путем хроматографии на колонке иэ слабоосновной полиаминовой смолы стирольного типа, распределительной хроматографии и кристаллизации.
В качестве ионообменной смолы берут смолу сульфоновой кислоты стирольного типа.
Антибиотик назван AT — 125.
Установили, что абсолютная конфигурация антибиотика AT — 1251 — (-nS, 5S) — а — амико- 3
«хлор - 2- изоксазоай 5- уксусная кислота.,Она
5 является амфотерным соединением и может встречаться в разных йонных формах в зависимости от значения рН окружающей среды. При низких значениях рН она существует в виде соли с кислотами, при более высоких значениях рН вЂ” в виде цвит1О териона и при еще более высоких значениях pH — в виде соли с металлом., AT — 125 ингибирует рост грамположительных и грамотрицательных бактерий, таких, как Raci I lus
subtilis, Escherichia coli. Он также действует на
15 различные грибы и дрожжи, например Saccharomyces pastorianus, Penicil lium oxalicun;, Candida
albicans, Saccharomyces cerevisiae. В связи с этим новый антибиотик можно применять отдсльно или в сочетании с другими средствами, предупреждаю20 щими развитие или боле знетворное действие микробов, для предупреждения роста бактерий, дрожжей и грибов или сокращения их числа н различных окружающих средах. Его можно применять, например, для обработки мест разведения
25 шелкопряда в целях предупреждения или умень50 531
15
25
35
Bacillus subti lis (в синтетическом агаре)
Baci I lus subti I is (в питательном arape)
Lactobacillus casei
Sarcina lutea
Staphylococcus aureus
Mycrobacterium avium
Escherichia coli (в питательном агаре)
Escherichia coli (в синтетическом arape)
Salmonel la schot tmuel ler i
Proteus vulgaris
Klebsiel la pneumoniae
Saccharomyces pastorianus
Peni ci I l ium oxaI icum
0
0
50
0 (очертания
36 ясны)
0
53
32 ения до минимума заражений, вызываемых Baci IIus 80Ы11ls.
ЯМЯ вЂ” спектр насыщенного раствора AT — 125 в
D, О определяли с помощью спектрометра типа
Varian X — 1 — 100. Спектр, полученный на п11иборе с частотой 100 Мгц, не был первого порядка и ясно показывал присутствие четырех незаменяемых протонов. Протоны метилена у С4 наблюдались в виде типичного мнимого (deceptive) 5-линейного образца АВ с самым сильным сигналом при 350 гц и очевидно с дублетами при 359. и 361 гц. Соседние протоны у С, наблюдались, как очевидный дублет триплетов, сосредоточенных при 5,36 О с распределением линий при 3,5 — 10 гц. Сигналом протона метиновой группы аминокислоты был дублет первого порядка при 4,12 h с .7 =3,5 гц. ИК вЂ” спектр вещества в ньюеле (Nujol) определяли с помощью спектрофотометра типа Perkin Elmer 421. Главные пики (за исключением ньюеля) были обнаружены при 3030 (широкий), 2730, 2620, 1620, 1590, 1495, 1425, 1405, 1325, 1307, 1293, 1275, 1145, 1127, 895 и 870 см
Химическая структура антибиотика AT — 125 в кристаллическом виде была точно установлена дифракцией рентгеновских лучей. Кристаллическому антибиотику AT — 125 можно дать химическое название 1 — /aS, 5S/ — а -амико- 3- хлор-2— изоксаэолин- 5-уксусной кислоты.
Молекулярный вес. Точное исследование рентгеновскими лучами показывало, что антибиотик
AT — 125 имеет структуру„соответствующую
С5Hg CINgOg с мол. вес. 178,6.
Растворимость. Растворим в воде и легко растворим в метаноле. Сравнительно нерастворим в этилацетате, простом эфире, бензоле и хлороформе.
Противомикробные свойства антибиотика
AT--125.
Следующие ниже результаты получали вследствие стандартного опыта с пластинчатыми дисками, причем применяли бумажные диски (размер 13 мм) и концентрацию AT — 125 1 мг/мл.
Микроорганизм Зона ингибирования вокруг бумажных дисФов (Ф 13 мм)
178
Candida albicans (испытано при 100 мкг/мл) 20
Saccharomyces cerevisiae (испытано пои 100 мкг/мл) 38 микроорганизм.
Лучистьй гриб, используемый дпя получения антибиотика AT — 125, Streptomyces Sviceus. Одной из характеристик его штамма является выделение
AT — 125.
Пересев живого микроорганизма был депонирован в NRRL 5439. Микроорганизм изучила и охарактеризовала Al ma D i et z сотрудник науч- но — исследовательской лаборатории Research
Laboratory.
Описание.
Streptomyces sviceus Dietz sp.n.
Цветная характеристика. При развитии на воздухе серьй. Меланин — положительньй. Цветные изображения на пленках Эктахром приведены в табл. 1 (1) .
Другие цветные характеристики приводятся в табл. 2. Культуру можно относить к серой (GY) и белой (И/)цветным сериям по Треснеру и Бакусу (2) .
Микроскопические характеристики. Споры овальной до прямоугольной формы, редко украшенные выростами или короткими шипами, с подсвечникообразными спорофорами. Спорофоры длинные, прямые с завивающимися концами. Спорофоры можно относить к спиральной группе (S) по Придхаму и др. (3). Поверхность спор можно относить к бородавчатой группе по 11иц и Мэфьюсу (4).
Куя ьтуральные и биохиь ические характеристики,см табл.3 Усвоение углерода Рост культуры на углеродных соединениях определяли методами по Придхаму и Готлибу (5! и Ширлингу и Готлибу (6). В методах по Придхаму и Готлибу S. sviceus очень хорошо рос на основной литатепьной среде, дульците, 0 — сорбите, салицине и оксалате натрия; хорошо на D — ксилозе, L арабинозе, рамнозе, 0 — фруктозе, 0 — галактозе, 0 — глюкозе, 0 — маннозе, мальтозе, сахарозе, лактозе, целлобиозе, рафинозе, декстрине, инулине, растворимом крахмале, глицерине, 0 манните, инозите, ацетате натрия, цитрате натрия, сукцинате натрия; плохо на феноле, формате и тартрате натрия; он не растет на крезоле и салицилате натрия. По методу по Ширлингу и Готлибу культура не растет на отрицательной контрольной среде (только на основной питательной среде). Он хорошо растет на положительной контрольной среде (основная питательная среда плюс глюкоза). Так же хорошо или лучше, чем на контрольной среде с глюкозой, он растет на основной питательной среде плюс 4 — арабиноза, сахароза, D — ксилоза, инозит, D — маннит, 0 — фруктоза, рамноза и рафиноза. Рост на целлюлозе точно не установлен.
503531
Температура, Культура растет хорошо при 18.
28оС на сахарном агаре по Беннету и Чапеку; при 18 — 37 С на мальтозноно- триптоновом агаре. (Она не растет при 45 и 55 С на сахарозном агаре по Беннету и Чалеку и на мальтозно-триптоновом агаре).
Свойства относительно продуцирования антибиотика. Культура выделяет антиметаболитньй антибиотик AT — 125.
Источник. Почва Streptomyces sviceus — лучистый гриб с характеристиками пода, как изложено в (7) .
Культура, которую изолировали из почвы, явно отличается от видов Sgreptomyces, находящихся в хранилище Vpjohn culture collection, и насколько это можно определить, от видов, описанных в литературе (8).
Streptomyces sviceus показьвал некоторое сходство с Streptomyces hawaiiensis (9). АТСС
122236. Обе культуры реагируют положительно на меланин и имеют сходные свойства усвоения углерода в синтетической питательной среде по Придхаму и Готлиэу. Streptomyces hawaiiensis имеет открытые спиральные спорофоры, более короткие и менее выраженные, чем спорофоры новой культуры, которые длинны с завивающимися концами. Как наблюдалось в электронном микроскопе в проходящем свете, споры имеют круглую до овальной формы и локрьпы тонкими шипами, что касается
S. hawaiiensis и овальную до прямоугольной формы с поверхностью, редко покрытой бородавками и шипами. Отличительные характеристики S. Sviceus приведены в табл. 4.
Благодаря характерным цветным изображениям и микроскопическим характеристикам
Sviceus легко отличать от характеризованных видов Streptomyces в хранилище Vpjohn culture со!—
lection и, насколько это можно определить, от культур, описанных в литературе. Культуральные характеристики, приведенные в таблицах, подчеркивают отличительные черты S. Sviceus. Уникальt ное свойство этого организма заключается в его способности выделять антибиотик AT — 125. Предлагается рассматривать организм, который здесь характеризуется, как новьй вид Streptornyces, назы1 ваемьй Streptomyces sviceus (от чешского слова
sv ice или svicen, означающего свеча или подсвечник — спорофоры культуры подсвечникообразны
Dietz, sp.n. Тип вида получил название разновидности Streptomyces sviceus наг, sviceus в соответствии с Правилом 9d (2) Международного номенклатурного кода для бактерий (10) .
Предлагаемое соединение получают выращиванием вырабатьвающего его организма в глубине водной питательной среды в аэробных условиях.
Для получения незначительных количеств соединения можно испольэовать и культуры на поверхностном слое жидкости. Гриб растет в питательной среде, содержащей источник углерода и усвояемое азотистое соединение или белковое вещество. Пред5
60 почтительные источники углерода: глюкоза, неочищенный сахар, сахароза, глицерин, крахмал, кукурузньй крахмал. лактоза, декстрин, меласса и т.п. Предпочтительные источники азота — кукурузньй экстракт, дрожжи, автолизированные пивоваренные дрожжи с твердыми частицами молока, соевая мука, хлопковая мука, кукурузная мука, твердые частицы молока, панкреатический перевар казеина, барда, пептонные жидкости животного происхождения, отходы мяса и костей и т.п. Целесообразно использовать углеродистые и азотистые вещества в комбинации. Так как используют водопроводную воду и добавки в неочищенном состоянии, то отпадает необходимость в добавлении микроэлементов, таких, как цинк, магний, марганец, кобальт, железо и т.п., к ферментационной среде.
Новое соединение получают при любой температуре, пригодной для обеспечения роста гриба, например 18 — 40 С, предпочтительно 20 — 32 С.
Максимум выработки соединения, как правило, достигается через приблизительно 2 — 10 дней. Значение рН во время ферментации обычно слабо — кислое.
В случае выращивания в больших сосудах и сборниках целесообразно использовать для посева скорее вегетативную, чем спороносную форму во избежание выраженного замедления выработки нового соединения и связанного с ним неэффективного использования приборов. В связи с этим желательна выработка вегетативного инокулума в питательной бульонной культуре засевом ее аликвотным количеством почвенной культуры или культуры на скошенном агаре. Полученньй таким образом молодой, активный вегетативный инокулум переносится в асептических условиях в большие сосуды или сборники. Среда,в которой вырабатывают вегетативньй инокулум, может соответствовать среде, используемой для получения нового соединения, или отличаться от нее в зависимости от обеспечения хорошего роста грибка.
Антибиотик AT — 125 является амфотерным соединением. Он растворим в воде и малорастворим я
СН3ОН, В целях выделения и очистки AT — 125 можно пользоваться различными способами, например абсорбцией с последующим вымыванием подходящим растворителем, колоночной и распределительной хроматографией, кристаллизацией из растворителей.
AT — 125 предпочтительно рекуперируют иэ питательной среды фильтрацией через кизельгур средней пористости, например. 40 ф — мы Игль Пичер.
Другие для этих целей пригодные сорта кизельгураэто, например, известные под торговыми названиями Super Cel (Johns manvilts fine diatomite), Dicaiife 4200 (Greaf Lakes, Miraflo 40 (гад!е Pic.-.
her,) (5,5 — 7,0). Конечное значение рН отчасти зависит от наличия буферов, если они вообще присутствуют, отчасти от начального значения рН пита503531 тельной среды, которое целесообразно установить перед стерилизацией приблизительно до 7,0.
В случае осуществления выращивания в больших сосудах и сборниках целесообразно использовать для посева скорее вегетативную форму, чем спороносную форму, во избежание выраженного замедления синтеза нового соединения и связанного с ним неэффективного использования приборов. В связи с этим желательная выработка вегетативного инокулума в питательной бульонной культуре засевом ее аликвотным количеством почвенной культуры или культуры на скошенном агаре. Полученный таким образом молодой, активньй вегетативньй инокулум переносится в асептических условиях в болыпие сосуды или сборники. Среда, в которой вьпрабатывают вегетативный инокулум, может соответствовать среде, используемой для получения нового соединения, или отличаться от нее в зависимости от обеспечения хорошего роста грибка. 20
Новый антиоиотик AT — 125 является амфотерным соединением. Он растворим в воде и малорастворим в СНЗОН.
В целях выделения и очистки AT — 125 можно пользоваться различными способами, например 25 абсорбцией с последующим вымыванием подходящим растворителем, колоночной и распределительной хроматографией, кристаллизацией из растворителей.
AT — 125 предпочтительно рекуперируют из пи- зо тательной среды фильтрацией через кизельгур средней пористости, например 40 ф — мы Игль Пичер.
Другие пригодные для этих целей сорта кизельгураэто, например, известные под торговыми названиями Super Cel (johns Manvill s fine diatomite, ç5
Dicalite 4200 (Great Lakes, Niraflo 40 (Eagle
Picher,.
Прозрачная исчерпанная питательная среда фильтруется через хроматографическую колонку с насадкой из стиролыюй смолы с сульфокислот- 40 ными остатками. Предпочитают водородную форму
Dowex 50, в частности плотно сшитый, например
Dowex 50 х 16. Другими пригодными смолами являются извесгные под торговыми названиями Amberlite IR 12 Nalcite HCR, Chempro С вЂ” 20, Permu- 45
tit О, Zeokarb 225.
После промывки колонки антибиотик вымывается основанием, в частности NH4ОН. Содержащие -антибиотик элюаты собирают, концентрир ют.
По предпочтительному способу очистки выше описанный водньй концентрат npP значениир
6,2 — 7,8 фильтруется через колонку с насадкой из слабоосновной стирольнополиамидной смолы, причем предпочитают Amberlite IR 45 (ОН ). Другие пригодные смолы — это, например,Amaer I ite I R 4В, Nalcite WBR, DeAcidite Е. Duolite А.2.
Колонку промывают деионизированной водой, 50 ным водным раствором МеОН и 90 o-ным водным раствором МеОН, а затем вымывают 0,1 н, уксусной кислотой в 90%-ном растворе МеОН. 6tI .!
15,0
1л йаМо04 2Н О
200 мкг/мл
Активные элюаты собирают и при уменьшенном давлении выпаривают досуха. МеОН можно заменить Н,О, Полученный остаток подвергают распределительной хроматографии, предварительно растворив его в нижней фазе системы растворителей, состоящей из смеси н — бутанола, бензола, метанола и деионизированной воды (2:1:!:1). Нижнюю фазу, содержащую остаток из колонки с насадкой из слабоосновной стирольнополиамидной смолы, гомогенизируют кизельгуром средней пористости, например, ф — мы Eagle Pichers Е® 40, и верхней фазой системы растворителей. Полученный гомогенизированный твердьй материал подают на колонку, содержащую кизельгур средней пористости и предварительно приготовленную взвешиванием кизельгура в верхней фазе описанной выше смеси растворителей, тщательно смешанной с нижней фазой, выливанием в хроматографическую колонку и, наконец,тем, что слою дают осесть, пока верхняя фаза проходит через колонку. Активные элюаты из колонки собирают, объединяют и выпаривают досуха. Кристаллический AT — 125 получают кристаллизацией подходящим растворителем, предпочтительно метанолом. Можно применять и 95%-ный этанол, водный бутанол и воду.
Другой способ рекуперации AT — 125 из фильтрованной исчерпанной ферментационной среды состоит в абсорбции на подходящей ионообменной смоле, напр. Dowex 1 (ОАС) при рН 9 — 10 или IR
45 (ОН вЂ” ) при рН 6 — 7. После промывки смолы Н О
AT — 125 получают вымыванием водным или метанольным NH4OH или уксусной кислотой. Далее фильтрованную прозрачную исчерпанную ферментационную среду можно абсорбировать на угле, после чего AT — 125 вымывают соответствующей смесью растворителей, например водным ацетоном.
По другому способу очистки можно хроматографировать на силикагеле метанолом в CHC I или
СН Cl > или смесями бензола (или толуола), 95 0 — ного этанола и уксусной кислоты.
Титр AT — 125 в исчерпанной питательной среде в отдельных стадиях рекуперации контролируют тестом с культурой Baci I lus Subtil is, разведенной в чашках Петри на синтетической среде следующего состава, г:
Na HPO4 7Н О 1,7
КН2 1 О 4 2,0 (МН„) SO 1,0 мазо, 0,1
Глюкоза 2,0
Bacto Адаг формы
О fcodaboratories
Detroit, Michigan
Дистиллированная вода
Основной раствор с ионами металлов++ 1 мп
Основной раствор с ионами металлов состоит из:
50353 l
С С
Си $0„
МП$04
CaCl
FeCl 4Н О
ZnCI 2
100 мкг/мл
100 мкг/мл
2 мг/мл
25 мг/мл
5 мг/мл
5 мг/мл
ЕпС1, должет быть растворен отдельно с применением капли 0,1 н. НС! на 10 мл воды. Основной раствор нагревается до растворения всех соединений, выдерживается сутки и фильтруется в стерильных условиях.
Эта среда засевается суспенэией спор B Subtil is (1,5 ° 10 клеток/мл) с концентрацией 0,5мл/л.
Пробы исчерпанной питательной среды наносятся на диски адсорбирующей бумаги диаметром 12,5 мм (0,08 мл/диск), диски инкубируются в течение ночи при 37 С, а затем измеряются зоны ингибирования. Соотношение между активностью пробы и диаметром зоны ингибирования вычисляется с помощью обычных стандартных кривых.
Засеянную В Subtilis среду можно также испольэовать для обнаружения антибиотика AT — 125.
Хроматограммы на бумаге проявляются верхней фазой смеси растворителей, состоящей из и — бутанола, метанола, бензола и воды (2:l„l:1). После проявления высушивают бумагу и кладут бумажные хроматограммы на прозрачные тарелки, содержащие засеянную среду и снимают их примерно через 20 мин. Тарелки инкубируют в течение ночи, как выше указано, а затем определяются зоны ингибирования.
Так как антибиотик AT — 125 является амфотерным соединением, он образует соли с кислотами, щелочными металлами (включая аммоний) щелочноземельными металлами (включая магний и алюминий) и аминами. Соли с металлами получают растворением AT — 125 в воде и добавлением разбавленного основания металла до достижения значения рН раствора 7 — 8. Соли AT — 125 с металлами включают соли с натрием, калием, кальцием. Аминные соли, включая соли с органическими основаниями, таки ми как первичные, вторичные и третичные, моно —; ди — и полиамины можно также получать, используя указанный выше или другие общеизвестные способы, Далее, аммониевые соли можно получать общеизвестными атособами. Другие соли получают с эффективными с терапевтической точки зрения основаниями, обусловливающими дополнительные терапевтические эффекты. К таким основаг чям относятся, например, пуриновые основания, такие как теофиллин, теобромин, кофеин или производные таких пуриновых оснований; антигистаминовые основания, способные образовать соли со слабыми кислотами; пиридиновые соединения, такие, как амид никотиновой кислоты, гидразид иэоникотиновой кислоты и т.п.; фенилалкиламиены, такие, как адреналин, эфедрин и т.п.; холин и др.
Кислые соли получают нейтрализацией AT — 125 соответствующей кислотой, доводя значение рН
2
10
Значение рН до стерилизации доводится до 7,2 при помощи 4 н. NaOH. Фермеитационнью колбы засевают ииокулумом в количестве 5 мл/100 мл ниже 7,0, предпочтительно до 2 — 6. Подходящими кислотами являются хлористоводородная, серная, фосфорная„сульфаминовая, бромистоводородная и т.п. Кислые и основные соли AT — 125 можно применять для тех же самых биологических целей, что и исходное соединение.
AT--125 действует íà Escherichia coli и служит ттля уменьшения, торможения и прекращения выделения слизи на целлюлозно — бумажных заводах благодаря своей противоЬактериальной активности, AT-125 можно также использовать для продления жизни культур Trichomonas foctus, Trichomonas
hominis, Trichomonas Vaginalis, так как он освобождает их от Escherichia col i. Далее, AT — 125 можно использовать в качестве фунгицида для обработки кожи для верха обуви по патенту C1JA
N 3130505. Так как ЛТ вЂ” 125 действует на Bacillus
subtilis его, кроме того, можно еше использовать для доведения до минимума или предотвращения запаха рыбы или ящиков для рыбы, вызываемого этим микроорганизмом. AT — 125 можно использовать также для очистки столов и оборудования в микологических лабораториях.
AT — 125 действует на 1.210, вызывающий в лабораториях лейкемию у мышей, и поэтому его можно использовать для их лечения.
При ме р l. А. Ферментация. Штамм Qtrepto,myces sviceus, NRRL 5439, из почвы используют для засева колб Эрленмейера емкостью 500 мл, содер. жащих 100 мл стерильной среды, состоящей из следующих компонентов, г/л:
Декстроза 25 г/л
Фармамедиа+ (продукт фирмы
Traders р l Mi 1 I Company, Fort Worth Texas) 25 г/л
Водопроводная вода до l л
До стерилизации среда, предназначетпая дпя засева, имеет значение рН 7,2. Инокулум выращивают в течение 2 суток при 28 С во вращающемся
4О встряхивателе по Гампу (250 об/мин) . Инокулум, йриготовленньтй указанным выше образом, применяют для засева колб Эрленмейера емкостью 500 мл, содержащих 100 мл стерильной ферментационной среды, состоящей из следующих
45 компонентов, г/л:
Карбонат кальция
Хлорид натрия
Крахмал
Маннит
Фитон (папаиновый перевар соевой муки) 10
КэйСой (тонко измельченная обезжиренная соевая мука)
55 Олеомаргарин из свиного сала 1 мл/100 мп
Водопроводная вода до l л.
503531
5
10 ферментационной среды. Ферментационные колбы выдерживают 2 — 3 суток при 32 С во вращающемся встряхивателе по Гампу (250 об/мин) . Максимальная выработка AT — 125 в ферментационной колбе, как правило, достигается через день после начала выделения по каплям титра антибиотика. Приведенная ниже зависимость типична для ферментационного процесса в колбе — встряхивателе.
Время, ч Бе/мл AT — 125
48 56
72 22
96 26
120 16
Биоединица активности (Бе) определяется как количество антибиотика, требуемое для получения двадцатимиллиметровой зоны ивгибирования диском диаметром 1,5 дюйма, обработанным 0,08 мл раствора антибиотика. Тест с диском проводят, как выше указано.
Б. Рекуперация.
Всю исчерпанную питательную среду (250л), оставшуюся от ферментации AT — 125, фильтруют, как выше указано, через кизельгур средней пористости. Образующаяся прозрачная исчерпанная питательная среда при значении рН 7 — 8 фильтруется через хроматографическую колонку с 25 л свежерегенерированного Dowex 50.16 (Н+). Колонку промывают 50л деионизированной Н Q и вымывают120л 1 н. ИН4ОН; затем собирают фракции по 6л. Самая активная фракция (зоны ингибирования > 50 мм) определяется нанесением смоченных и высушенных на воздухе дисков на тарелку с
Baci I lus subti I is, выращенным в синтетической среде, как выше указано. Активные фракции объединяют и концентрируют при пониженном давлении в целях удаления избытка МН ОН. Определение твердого материала показывает, что сырой водный концечтрат содержит 2950 г, а активные элюаты 244 ã. Тверпьй материал в активных элюатах приблизительно в 13 раз активнее по отношению к Baeilllus subtilis, чем твердый материал, содержащийся в прозрачной исчерпанной питательной среде, В. Очистка. (1) Колонкой иэ слабоосновной стирольнополиамидной смолы.
Активный в одньй концентрированньй элюат из
Dowex — 50, полученный, как выше описано, при значении рН 7 — 7,5 фильтруется через колонку, со15
2S
50 держащую 4л Amberlite IR 45(ОН ). Колонку промывают 8 л деионизированной Н2 О 4 л 50 o-ного водного МеОН и 8 л 90 -ного водного МеОН, а затем вымывают 0,5 н. уксусной кислотой в
90%-ном МеОН; собирают фракции по двум литрам. Самые активные фракции относительно Baci I.lus suPti l is объединяют и выпаривают досуха при пониженном давлении; выход составляет 9,40 г остатка с активностью относительно Baci I l us
subti l is, превышающей активность остатка описанного выше элюата из Dowex — 50 в 28 раз (2) Распределительная хроматография.
Смесь н — бутанола, бензола, метанола и деионизированной воды (2:1:1:1) перемешивают, затем смеси дают разделиться на два слоя; слои разделяют. Кизельгур средней пористости (2340 г) взвешивают в верхней фазе, тщательно перемешивают с 900 мл нижней фазы, а затем выливают в хроматографическую колонку и дают слою осесть, пока верхняя фаза проходит через колонку. Остаток элюата из I R45,,полученного,,как выше указано, растворяют в 25 мл нижней фазы и гомогенизируют 75 г кизельгура средней пористости и 50 мл верхней фазы. Получаемый гомогенизированньй твердьй материал тщательно подают на колонку и начинают вымывание верхней фазой; собирают фракции по 500 мл. Самые активные относительно Baci I lus subt i I is фракции выпаривают досуха при пониженном давлении, что дает 3,93г остатка, активность которого относительно Baci I lus
subti l is превышает активность описанного выше остатка элюата из I R 45 в 2,9 раз. (3) Кристаллизация.
Описанньй остаток, полученньй распределительной хроматографией, кристаллизуют из СНз ОН и перекристаллизуют иэ водного СНЗ ОН 3 раза, что дает 362 мг чистого кристаллического AT — 125, активность которого относительно Bacillus subti I à превышает примерно в 4раза активность высокоактивного остатка, полученного в результате описанной выше распределительной хроматографии.
Соли антибиотика AT — 125 можно получать по описанным способам. Эти соли, как улсаэано вьппе, служат для тех же целей, что и исходный антибиотик, Вышеизложенное изобретение было сделано в рамках контракта PH43 — NCI — 69 — 1023 с National
cancer institute, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland д3(Ц4, 503531
13
Габлиыа 4
Агаровая среда
Обратная сторона
Лицевая сторо
Лавандово — серая
Не растет на воздухе
Светло — лавандово — серая
Беннета
Сахароза Чанека
Мальтозно-триптоновая
Пептонное железо
Тирозин (концентрация 0,1%)
Казеиновый крахмал
Цветные изображения Streptomyces sviceus на пленке ктахром (11) Коричневая
Красно — коричневая
Коричневая
Коричневая
Красно — коричневая
Светло — коричневая
503531
16 у
E И
Е
Д ое
00 Ch 3 л
1 о о и р ф о
М о
Д
М о о
R.
Р ф
) II (@5 ( (ф лл
2 (Ч сБ
3 о
z 5
J
И, 8
34
Щ
Ж о о ж о
<р if)
ill ь О) с С ) о о
LCl д
0) у с и
Ь с î
O) в а
z о о ь—
Лд
Б о
О
Щ с
I o о„„С3 и
«Ц Б
Я р, Я
g Ф
О
5,(5у
Е а) ЭЩ
1
Й
Ф
8
ЭЦ (Ф о о в
Cl 6
Е Eca
ЙЖ
Я (I но.
О
E зЩ
4I
1 о
„И
М
Й
Е 2 о 1
98
6 j ф
„o (1 о ф й о
E
Я р зф
8®
j(3 йф
Ое
00 о
1 щ м
8 v
I о И (v ohio о) Е юю со Зоо о
Ю ч- с
Ф9 Ф и о
Ф
5 о
Ф
Е о, и
"3 д Р
gII
М Q
E св
503531
17
)х
4
О о
1 о н и
Е о
О
Х
)х й
>х
l о н
Р х о
М
)Я
sss о
Е о и о
О
)х
»4
»»
О о
I о х н
Ф о
Е Е
И о
Б
)х
Р ф
О»
Й
)х
Ц ф
)Я р
8 И о
1 о н о х
О
sO о
ЧС ) у
Ф
Ч)Я о
)Щ
)Ф
О
1 о н
Ц о о
)х
Ф
lO о о
Ь
Ц о х о х
М
И х х
I я
)О
0 и
H о
1 х х
О
И х х »
М »
И м
2 х о
)s) о
<Л
E о
Ф»
Cl
)"
4»
rn х
К
Б х
О, О. и
4 х н и
»»
4 х
Д
О о
О
I о
М
Ф»
K. о
". к
>х 1 о н н о
Ф
Ф о о) os о
>О
М
)х о х
Д
lO ъ
1-1
О
1 о
О о
)s) Us м с) о
)» о о й1
)Я х а а о»» о
1 о о
>)» д о о о о
)х Е ,):) )» х нх осч о
E os
Й о
Й
О, 8 о о
О
8 и о
C(Е
)х
° » о
l о о
М л
6
Ф О, о о
3
Ий (H,е .. о
)х
»4
\ °
Ф
Е
О о
М
1 о н
2 Î Oо
>х о
Й о
Е 8 о
)х
»s)
И и
О о
М
I о
)х
Ф о
Е
Ct о
)х
4
О. о
М
1 о н о о Z
>х и
Й
Й
О
)х
А
)»
И
И
О о
М
I о
Й
М
Й
)х
»
6 н
Р о
Е с
)х
Р о
О.
М
I о о
И
6 о
)х и
_#_
И о
Г» о о
8 и
О,! as! х о
Q о
Й
М о
\Ф
3 и о
Й
Я
Р о
3
Г, о
503531
19
М
Эф о ж
%
I ф
Ф н .2
Е о
Х
ЭЯ ж о
ЭЯ м о
Ц о
И
Р о о
Д и о о и
8, И
И
М
I о о и
Ж ф о
3 о
i4 и й 3
Ф
Ф
ID
Ф
И
3 о о
Ь
8
1 о
8 о и о I
Э» о р, I
8 о
Э»
Ц о
Pi х.
I о
Ц
О 1 3и о а
II„: Ö I g аф .(5 и
Ц
ЭЯ
И
М
Р о
Й
9
1 о
Ф о
Р
v н
Й
Й ф о
Ьч о о и
3
1
Й и
3
5 о
ЭИ
6 » у
Эф о ф
О, 8
f о о
1 о
И
Я
6
ЭЯ
° 4 о
b4 о
Эф о ф о о м
s,5
2 о
3
Ц
Р и
Ь» о о
6
8 о
И
8, и
8 И
5 о о
Ц о
М, 1 о
Д о
ЭЦ ф
»
I8 о®®
v ж
С4
Д
Е ъ и и о о ф
2 н
8.
Ф
8
Е о
Ф4 о ж
Х
М о
М о й
Д ф о о
М
И о й1 о
Ф ф
eS и
В и3 о
Х
И
8 о ф o ) а о н й
5 и
Ь: о
ЭЯ ц н И ф
) 2 И о ф
v 6
503531
5 я оси ооо н ф
О, Ф ф3 ,ф Р м о" и ф 6 жф о о ф н
18 3 о н gg 8
503531
1. Способ получения антибиотика путем культивирования Streptomyces в азробных условиях в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости и очисткой, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью получения антибиотика, имеющего структуру
С1
ÄÄC11Ä Се
2 а
> ъ11 С11-СИ-СО, ( а используют Streptomyces sv iceus.
2. Способ по п. 1, от лич а ющи и ся тем, что фильтрат культуральной жидкости абсорбируют ионообменной смолой и далее злюируют целевой продукт.
3. Способ по и. 1, отличающийся тем, что очистку целевого продукта производят путем хроматографии на колонке из слабоосновной полиаминовой смолы стирольного типа, распределительной хроматографии и кристаллизации.
4. Способ по п.2, от лича ющи и ся тем,что в качестве ионообменной смолы применяют смолу сульфоновой кислоты стирольного типа.
1.. D:etz А. 1954 Апп Р V Асад. Sci
60:152 — 154.
2. Trasner, Н.D and Е.g. Backus 1962. Appl.
Microbial 11:335 — 338.
3. РпдПат, T. G.C. W Hesselt inc and R.G.
Benedict, 1958 Appl. Microbiol 6:52 — 79.
4. Dietz А., and john Mathews 1970, Арр1.
Mi c rob i o l 21: 527 — 533.
5. Pridham, Т.G. and D. Gottlieb, 1948. g.
Bacteriol 56:107:114.
6. Shi ri ing Е В., and D. Gott l ieb. 1966.
Zni. j. Syr. Bacterio 16:313 — 340.
Составитель М. Дражжинников
Те р еп М. Левицкая Корректор С. Шекмар
Н..цактор Л, 1(овожилова
Заказ 955/504
Тираж 555 Подписное
ЦНИИПИ Госуцарсгвенного комитета Совета Минисгров СССР о делам изобретений и открытий
1 13035, Москва, Ж-35, Раугнская наб., д. 4/5
Филиал ffflff ffAeer", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
Формула изобретения
7. Bergey s Manual of Determinative Bacte.riology, 7-е издание (Breed Robert, $., E.G. Mur .ray, and Nathan R Smitz 1957 Bergey"s manual of
determinative bacteriology, Zth Edition, the Wi l.liams and WiIkins Co., Baltimore.
8. Bergey s Manual под именем Гаузе Г,Ф.
Преображенская Т,П.,Кудрина Е.С., Блинов Н.О., Рябова И.Д. и Ивешник М.А. Вопросы классификации антагонистических актиномицет. Госуд. Издательство Медицинской литературы, Москва, 1957 г, Хюттером (Hutter, R f967. Systematik der
streptomyceter unter besonderer Beriicksichtigung
der von ihnen gebildeten Antibiotika, S, Karger, BaseI), Красильниковым Н.А., Руководство по определению бактерий и актиномицет, Акад, Наук
СССР, Москва, 1957, Ваксманом (Waksman, S.À.
1961. The actinomycetes, vol 2, Classification, identification, and descriptions of genera and spe
cies. The Williams and Wilkins CO., Baltimore), и
Ширлингом и Готлибом (Shirl ing, Е, В., and О.
Gottl ieb. 1968 Tnt.j. Sus. Bacteriol 18:69:189;
18:279 — 392; 19:391 — 512).
9. Cron. М.j., DF Whitehead, I.R. Hooper, В., Heinemann and j Lein, 1956 Antibiotics and cre—
motherapy 60:63:67.
10. Intern, ) System Bacteriol 16:459 †4.
11.. Dietz, А., Annals of the New Vork
Academy of Sciences, 60:152 — 154, 1954.
12. jacobson, Е., W.Ñ. Granvil le and С. Е.
Foss. 1948, Container Corporation of Americs, Chicago, gelinois.
13. Kelly, К. 1., and D.Â. judd, 1955, V.S.
Dept. Commerce Circ 553.
14. Tresner H. 0 and Е. j. Backus. 1962
Appl. Michob iol. 11:335 — 338.
15. Pridham, Т.С., et. al. 1958. Арр! Michobiol 6:52 — 79.
16. Dietz, А. and john Mathews 1970. Appl
Michobiol 21 — 521 — 533.