Способ получения фермента для лизиса клеток микроорганизмов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП И

111> 503532

Союз Советских

Социалистических

Республик

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 13.12.72 (21) 1862803/28-13 (51) М. Кл С 12D 13/10 (23) Приоритет (32) 14.12.71 (31) 100700/71 (33) Япония

Опубликовано 15.02.76. Бюллетень № 6

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 577.15.08 (088.8) Дата опубликования описания 21.09.7б (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Рейсуке Кобаяси, Хиронаи Сато, Киеси Такита и Нобуо Тояма (Япония) Иностранная фирма

«Кум иан Кем икал И ндастри Ко., Л ТД» (Япония) (71) Заяви1ель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА ДЛЯ ЛИЗИСА КЛЕТОК

МИКРООРГАНИЗМОВ

Изобретение относится к области ферментной промышленности, а более точно — к способам получения литических ферментов.

Известен способ получения литических ферментов путем культивирования их продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода и азота с последующим выделением фермента из среды.

С целью получения фермента с более высокой литической активностью в предлагаемом способе в качестве продуцентов используют микроорганизмы рода Pellicularia.

Из рода Pellicularia используют вид Pellicul aria sasakii или filamentosa.

Способ заключается в том, что микроорганизмы рода Pellicularia выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, с последующим выделением ферментов известным способом.

Выращивание может осуществляться как глубинным, так и поверхностным способом при

15 — 40 С в течение 28 — 240 ч.

В качестве источника углерода могут быть использованы крахмал, глюкоза, сахароза, отруби пшеницы и риса. Источниками азота являются соли аммония, нитраты, пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, обезжиренная соевая мука и т. п. Также можно вводить стимуляторы роста такие, как витамины, распыленные сухие дрожжи, хлореллу, гриб шляпочный и т. д. Из минеральных солей можно вводить соли калия, магния, кальция, 5 железа, фосфора и др.

Глубинный способ выращивания осуществляют при 20 — 35 С в течение 48 — 120 ч в аэробных условиях, а поверхностный способ— при тех же температурах в течение 3 — 10дней.

10 При глубинном способе полученную культуральную жидкость фильтруют, выделяя биомассу, которая может быть использована в качестве лизирования клеток различных микроорганизмов или эту биомассу можно высу15 шивать при температуре ниже 0 С.

При поверхностном способе выращивания ферменты экстрагируют из культуры водой или буферным водным раствором (рН = 4,0—

7,0) .

20 Для того чтобы выделить сложный фермент в состоянии наиболее чистого ферментного препарата из культивируемой среды, содержащей эти ферменты, могут быть удалены твердые вещества посредством, например, 25 фильтрации или центрифугирования, или же эта культивируемая среда может быть подвергнута экстракции водой или буферным водным раствором. Получаемый в результате

3 водный сырой раствор сложного фермента может далее подвергаться обработке известным обессоливающим агентом, например сульфатом аммония, хлоридом натрия, или me смешиваемым с водой органическим растворителем таким, как низшие алифатические спирты, например метиловый или этиловый спирт, или ацетон, с целью выделения этого сложного фермента из сырого раствора.

Для дальнейшей очистки осажденныи сложный фермент может растворяться в соответствующем буферном растворе ацетата концентрацией 0,0t М и ферментативный раствор может далее подвергаться диализу или процессу гель-фильтрации. Полученный таким ооразом очищенный ферментативный раствор может затем подвергаться сушке при температуре ниже 0 С, в результате чего получается очищенный ферментативный препарат, состоящий в основном из желаемого сложного фер мента. тот сложный фермент, получаемый из

Pellicularia sasakii, и сложный фермент, получаемый из Pellicularia filamentosa, согласно предлагаемому спосооу растворимы в воде, но нерастворимы в ацетоне и в этаноле. Все эти ферменты имеют общие характеристики: они являются активными в отношении лизирования живых и мертвых клеток бактерий, грибов, дрожжей, базидиомицетов и хлореллы; их активность в отношении лизирования стенок клеток является стабильной при величине рН 3 — 9, причем оптимальная величина рН

5 — 7; они имеют оптимальную активность (активность в отношении лизирования стенок клеток) при 30 — 40"С, но эта оптимальная температура слабо изменяется в зависимости от природы микроорганизмов, клетки которых подвергаются лизированию; активность в отношении лизирования стенок клеток является стабильной в интервале низких температур, но эта активность снижается при температуре выше 50 С; их активность в отношении разрушения стенок клеток снижается в результате присутствия ионов Мп++, 1++ или Zn++; обладают ферментативной активностью целлюлозы, глюканазы, хитиназы, протеазы, геми-целлюлазы и карбоксиметилцеллюлазы; они в основном состоят из компонентов ферментов, каждый из которых имеет молекулярный вес не менее 50 000.

Можно полагать, что лизирующий стенки клеток сложный фермент, полученный из

Pellicularia sasakii, и сложный фермент, полученный из Pellicularia filamentosa, представляет собой смеси целлюлазы, глюканазы, хитаназы, протеазы, геми-целлюлазы и карбометилцеллюлазы в форме сложного соединения, и они имеют высокую активность в отношении лизирования клеток различных микроорганизмов благодаря синергичному действию отдельных составляющих ферментов, хо503532

4 тя можно полагать, что эти сложные ферменты, полученные из различных видов Pellicularia, имеют составы, которые в большей или в меньшей степени отличаются один от другого, поскольку эти сложные ферменты имеют различные свойства и различную ферментативную активность.

Согласно изобретению предлагается сложный фермент, лизирующий стенки клеток, выбранный из числа сложных ферментов, полученных при помощи известного штамма Pellicn!аг1а sasakii и из числа сложных ферментов, полученных из известного штамма 1 еШси1аria tilamcntosa, причем все эти сложные фер15 менты имеют следуюшие общие характеристики: активность в отношении лизирования живых и мертвых клеток, по крайней мере таких организмов, как Aspergillus niger, Penicillium

steckii, Saccharomyces cerevisial, Candida utilis, Candida albicans, Candida lipolytica, Lentinus edodes, Bacillus subtilis, 1 actobacillus

lactis и Chlorella; стабильная активность в отношении лизирования стенок клеток является при величине рН = 3 — 9, причем оптимальная величина рН составляет 5 — 7; оптимальная активность в отношении лизирования стенок клеток при 30 — 40 С, но оптимальная температура изменяется в зависимости от природы микроорганизмов, стенки которых подвергаются лизированию; стабильность активности в отношении лизирования стенок клеток при низких температурах и быстрое снижение ее при температуре выше 50 С; снижение активности в отношении лизирования стенок клеток в присутствии ионов

Мп++, %++ или Zn++; ферментативная активность равная активности целлюлазы, карбоксиметилцеллюлазы, глюканазы, хитиназы, протеазы, геми-целлюлазы и амилазы; молекулярный вес компонентов ферментов в основном не менее 50 000.

Сложный фермент, образуемый из Pellicularia sasakii, обладает активностью такой целлюлазы, которая имеет оптимальный температурный предел 40 — 50 С и оптимальную

5о величину рН = 5,0, например активностью

Р-1,3-глюканазы, которая имеет оптимальный температурный предел 40 — 50 С и оптимальную величину рН = 5,0 и обладает активностью такой хитиназы, имеющей оптимальную

55 температуру 35 С, и оптимальную величину рН = 4,0 — 5,5. Сложный фермент, полученный из Pellicularia filamentosa, обладает, кроме того, такой активностью целлюлазы, которая имеет оптимальный температурный предел

40 — 50 С, например активностью Р-1,3-глюканазы, которая имеет оптимальный температурный предел 40 — 50 С и оптимальную величину рН = 5,0, и такой активностью хитиназы, имеющей оптимальную температуру 35 С и оптимальную величину рН = 4,0 — 5,5.

503532

Активности в отношении лизирования стенок клеток, которые обозначаются как общепринятые характеристики (Ь) — (1) сложных ферментов, соответствующих изобретению, определяются следующим способом и в следующих масштабах.

1!олучаемое количество сложных ферментных препаратов химически реагирует с 5 мл суспензии клеток Candida utilis iFD — 0,396, которые имеют исходную мутность, соответствующую оптической плотности (О. Д.), равной 1,0, измеренной при длине волны 660 нм.

Эта реакция осуществляется при 35 С в течение о0 мин при величине рН = 5,0. После завершения реакции оптическая плотность суспензии клеток, содержащей лизированные и нелизированные клетки, измеряется при длине волн 660 нм. В случае, когда прореагировавшая суспензия клеток теряет 1 " мутности (или величины О.Д.) по сравнению с исходной суспензией клеток, то указанное количество сложного ферментного препарата имеет активность в отношении лизирования стенок клеток равную единице. Кроме того, активность целлюлазы, активность Р-1,3-глюканазы и активность хитиназы в отношении указанных выше сложных ферментов, соответствующих изобретению, измеряются в соответствии с приведенным ниже описанием в примере 13.

В случае когда лизирование, а именно растворение стенок клеток микроорганизмов осуществляется при использовании сложного фермента, то этот фермент химически реагирует с клетками микроорганизмов, суспензированных B воде. Желательно, чтобы реакция протекала при 20 — 60 и преимущественно при

30 — 40 С при рН = 2 — 10, и лучше при рН =

= 3,4 — 8,0. Температура реакции и величина рН могут быть заданы в соответствии с природой микроорганизма, стенки клеток которого подвергаются лизированию под воздействием сложного фермента. Клетки микроорганизма, подвергаемого лизированию, могут быть либо живыми, либо мертвыми, при их контактировании с ферментом. В любом случае почти все клетки могут растворяться благодаря лизированию стенок клеток и содержимое (внутриклеточное вещество) клеток может удаляться в водную фазу суспензии клеток через 20 ч после начала реакции.

Для того чтобы осуществлялась реакция сложного фермента с клетками микроорганизма, любой ферментный препарат в форме твердого порошка или его водного раствора, или питательного бульона культура, или экстракта этой культуры может быть добавлен в суспензию клеток в воде, величина рН которой доведена до оптимальной величины для осуществления ферментативной реакции. Наряду с этим эти клетки могут быть введены в раствор ферментного препарата в воде или буферный раствор, величина рН которого доведена до оптимальной для осуществления ферментативной реакции.

Когда реакция осуществляется до полного

65 ее завершения, то клетки полностью растворяются, не оставляя никакого твердого осадка в растворе. Однако в некоторых случаях количество твердого остатка остается даже после полного завершения реакции. Возможность растворения клеток до желаемой степени может быть установлена путем определения изменения мутности суспензии клеток или концентрации растворимого компонента протоплазмы клеток или посредством микроскопического наблюдения в условиях наличия клеток в растворе. Таким образом, может быть получен водный раствор клеток, в котором вещество оболочек клеток и протоплазма клеток растворяются в воде вместе с используемым сложным ферментом.

По желанию полученный раствор клеток может быть отфильтрован для удаления люоого твердого осадка. Этот раствор может быть также нагрет для деактивации оставшихся ферментов в случае, если это необходимо.

Далее раствор может подвергаться обработке путем простой дегидратации или выпаривания в вакууме, в результате чего получается сухой продукт. Раствор клеток может также обрабатываться соответствующим образом, например путем экстракции или хроматографии для извлечения из него любого ценного вещества или веществ.

Предлагаемые сложные ферменты способны лизировать клетки (стенки клеток) различных микроорганизмов таких, как бактерии, грибы, дрожжи, базидомицеты, а также хлореллу.

Это свойство сложных ферментов является более положительным и более ценным, чем, например, свойства известных ферментов, которые извлекают из культуры Corticium го1Ьй.

Фермент, извлеченный из данной культуры

Corticium rol fsii, имеет оптимальный предел величины рН = 2,0 — 2,5 и ограниченную активность, так что он может лизировать лишь стенки клеток дрожжей и хлореллы. Микроорганизмы разновидности Corticium могут быть отличимы от микроорганизмов разновидности

Pellicularia в том отношении, что первый образует такой сплошной спорообразующий слой плодового тела, в котором базидий расположен в непосредственной близости, в то время как последний образует спорообразующий слой плодового тела с разрывом сплошности, в котором базилии находятся на расстоянии друг от друга.

Согласно изобретению предусматривается способ растворения клеток микроорганизмов, включающих бактерии, грибы, дрожжи, базидиомицеты и хлореллу, который заключается в обработке суспензированных клеток в водной среде сложным ферментом, лизирующим стенки клеток, являющимся известным штаммом Pellicularia sasakii или Pellicul aria filamentosa или питательным раствором культуры указанного штамма, или его экстракта.

Сложный фермент, лизирующий стенки клеток, может быть использован для экстракции ценных внутриклеточных веществ из клеток, а

503532 также для получения концентрированного экстракта, содержащего питательные вещества или другие ценные вещества, присутствующие в протоплазме клеток различных микроорганизмов таких, как дрожжи, хлорелла, бактерии и грибы.

Для этих целей эти клетки обрабатывают сложным ферментом в воде для лизирования стенок клеток и освобождения протоплазмы, в результате чего получается раствор клеток, который далее может быть частично дегидрирован или полностью дегидрирован с получением концентрата или сухого порошка. Кроме того, сложный фермент, лизирующий стенки клеток, соответствующий изобретению, может быть использован для предотвращения порчи пищевых продуктов или напитков, путем введения в них эффективно действующего количества сложного фермента и путем растворения клеток бактерий или грибковых организмов, которые могут присутствовать или могут быть занесены в пищевые продукты или напитки, и для которых свойственно вызывать порчу пищевых продуктов или напитков.

Таким образом, сложные ферменты находят широкое применение во многих областях, например в пищевой, фармацевтической промышленности, в производстве пестицидов и в приготовлении кормов.

Пример 1. В коническую колбу емкостью 300 мл помещают 19 r пшеницы, 1 r высушенных дрожжей и 18 мл воды. Затем эту колбу нагревают и содержимое ее перемешивают, в результате чего получают однородную пастообразную смесь. Эту среду подвергают обработке паром при 120 С в течение 20 мин с целью стерилизации. Исходную культуру

Pellicul aria sasakii подвергают инокулированию на стерильную культуральную среду.

Выращивание в твердом состоянии штамма

Pellicularia осуществляют в течение 120 ч при постоянной температуре равной 28 С. Полученную в результате культуру смешивают с

80 мл буферного раствора ацетата с рН = 4,0 и эту смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч с тем, чтобы ферменты экстрагировались в жидкую фазу.

Затем эту смесь фильтруют при постоянном давлении, и полученный фильтрат центрифугируют, в результате чего получают 70 мл прозрачного раствора, содержащего сложный фермент, полученный из РеШсп1апа sasakii.

К этому раствору добавляют 120 мл ацетона, в результате чего выпадает в осадок сложный фермент. Осадок фильтруют и высушивают, получают 700 мг ферментного препарата в порошкообразном состоянии.

Ферментный препарат является активным в отношении лизирования стенок клеток различных микроорганизмов, включающих бактерии, грибы, дрожжи, базидиомицеты и хлореллу.

Пример 2. В коническую колбу емкостью 300 мл помещают 10 г отрубей пшеницы, 10 г отрубей риса, 2 г пептона и 20 мл воды.

Колбу нагревают и содержимое колбы перемешивают, получая однородную пастообразную смесь. Культуральную среду подвергают обработке паром при 120 С в течение 20 мин

5 с целью стерилизации.

Исходную культуру Pellicularia filamentosa инокулируют до стерильной культуральной среды.

Выращивание в твердом состоянии штамма

10 Pellicularia осуществляют при 28 С в течение

170 ч. Полученную культуру смешивают с

80 мл воды и тщательно перемешивают при комнатной температуре с тем, чтобы ферменты экстрагировались в водную фазу..

15 Смесь фильтруют под давлением и полученный фпльтрат центрифугируют, в результате чего получают прозрачный раствор, содержащий сложный фермент, полученный из

РеШсц1аг1а fi 1amentosa.

20 К раствору добавляют сульфат аммония до достижения степени насыщения 70 /ц и таким образом осаждают сложный фермент. Осадок фильтруют и сушат, получают 1 г ферментного препарата в порошкообразном состоянии.

25 Этот препарат является активным в отношении лизирования стенок клеток различных микроорганизмов, включающих бактерии, грибы, дрожжи, базидиомицеты и хлореллу.

Пример 3. В коническую колбу емкостью зо 1 л помещают 9 г сахарозы, 6 г отрубей риса, 0,6 r порошкообразного высушенного гриба шляпочного (Continellus shutake), 1,5 г сульфата аммония, 1,5 г первичного кислого фосфорнокислого калия, 0,3 г хлористого калия, 35 0,3 г сульфата магния и 0,003 r сульфата железа (двухвалентного). К содержимому колбы добавляют 300 мл воды с целью растворения растворимого вещества.

Эту культуральную среду в виде водного

4о раствора стерилизуют путем обработки паром при 120 С в течение 20 мин. Исходную культуру Ре111си1аг1а filamentosa инокулируют на стерильную жидкую культуральную среду.

Выращивание при одновременном взбалты45 ванин штамма Pellicularia осуществляют при

23 С в течение 120 ч. Полученный таким образом питательный раствор культуры фильтруют, удаляя присутствующее в нем твердое вещество, выпаривают до получения объема, 50 составляющего одну треть от исходного объема, путем диализа через диализную мембрану.

К концентрированному раствору добавляют

400 мл водного 99 / -ного раствора спирта, в результате чего осаждают сложный фермент.

55 Осадок фильтруют и сушат, получают 450 r ферментного препарата в порошкообразном состоянии. Ферментный препарат является активным в отношении лизирования стенок клеток различных микроорганизмов, включа5О ющих бактерии, грибы, дрожжи, базидиомицеты и хлореллу.

Пример 4. В коническую колбу емкостью 300 мл помещают 5 r тонко измельченных отрубей пшеницы, 0,5 г сульфата аммо55 ния, 0,5 r первичного кислого фосфорнокисло503532

9 го калия, 0,1 г хлористого калия, 0,1 г сульфата магния, 0,001 г сульфата железа (двухвалентного) и 100 мл воды. Содержимое колбы стерилизуют путем обпаботки паром при

120 С в течение 20 мин. Исходную культуру

Pellicularia sasakii инокулируют на стерильную жидкую культивируемую среду. Инкубацию при одновременном встряхивании осуществляют при 28 С в течение 24 ч посредством вращающего встряхивателя, в результате чего получают жидкую семенную культуру.

На 5 деревянных желобах помещают соответственно 200 г отруоей пшеницы, 5 r порошкообразного высушенного шляпочного гриба (Cortinellus shutake) и 160 мл водного 5 /О-ного раствора сульфата аммония. На каждом желобе эти материалы тщательно перемешивают один с другим, получая однородную смесь, которую затем стерилизуют путем обработки паром. 20 мл полученной жидкой семенной культуры, указанной выше, инокулируют до получения культивируемой среды на к а ждо м желоб е.

Стационапное культивирование осуществляют ппи 28 С в течение 96 ч. Культупы на этих желобах смешивают одну с другой и соединенн1 ю культур; экстрагируют 4 л водного буФерного раствора апетата с рН = 4,0.

Экстракт Фильтруют под давлением и фильтпат пентрифугируют, в результате чего получают 3.6 л ппозрачного раствора, содепжащего сложный Фермент, полученный из Pelliculaгia ваяаЫ1. К этому ппозрачному pacTBopv добавляют сульфат аммония до степени насышезия 700/, осаждая сложный Фепмент.

Осадок собирают и вводят в 900 мл воды.

Водный раствор фермента лиофилизчпуют в вакууме, в результате чего получают 32 г ферментного препарата в виде порошка.

Фепментный препарат является активным в отношении лизирования стенок клеток различных микроорганизмов. включающих бактерии, гП-бы. дпожжи. базидиомицеты и хлореллу.

П и и м е р 5. В кажд ю из трех конических колб емкостью 300 мл помещают 19 г отрубей пшеницы, 1 г выс шенных дпожжей и

18 мл воды, и содеп>кимое каждой колбы нагпевают и перемешивают, в пезаж льтяте чего получают одноподную пастообпазную смесь.

Эту питательн ю срел степилиз ют путем обпаботки папом ппи 1п0 С в течение 20 мин.

Исходные к льт пы Pellicularia sasakii u

Pellicularia filamentosa инокулируют соответственно в указанных колбах на стерильной гпеде. Выращивание в твердом состоянии осуществляют в течение 120 ч ппи постоянной температуре равной 28 С. После выращивая-ния получаемые к льтуры смешивают с попциями по 80 мл буФепного раствора ацетата, и смеси перемешивают ппи комнатной температуре в течение ч с тем. чтобы с.зо>кные Фепменты. получаемые из различных ви. ов Pellicularia, экстр агировались в жидк..е

Аазьь Эти смест фильтруют под давлением " получаемые фильтраты центрифугируют, в рс5

C) 5

10 зультате чего получают порции по 70 мл трех прозрачных растворов, содержащих сложные фепменты, соответственно.

С другой стороны, суспензии клеток грибов, дрожжей, бактерий и хлореллы в воде приготавливают из культу р Aspergillus niper, Penicillium stecku. S accharomyces cerevisiae IFO0209, Candida utieis IFO-0396. Candida albicans, Candida lipolytica u Lentinus edodes, каждую из которых инкубиру|от в мальтовой среде; культуры Bacillus subtilis u Lactobacillus bactis инкубипуют в бульонной среде, и к льтуру Chlorella pyrenoidosa — в среде

Nakamura, соответственно. Каждую из этих суспензий клеток, приготовленную указанным способом, помещают в три испытательные трубки. Затем в эти трубки, каждая из которых содержит суспензию клеток, вводят порции по 20 мл указанных выше трех прозрачных растворов соответствующих сложных фепментов. Содержимое каждой испытательной трубки остопожно взбалтывают в течение

20 ч в водяной бане ппи постоянной температупе равной 35 С, так что эти ферменты химически реагируют со стенками клеток, раствопяя эти клетки в суспензии. Суспензии этих клеток наблюдают под микпоскопом с целью определения в какой степени эти клетки раствопяются или перевариваются под воздействием сложных ферментов Pellicularia и РеШculaiia filamentosa.

Степень растворения этих клеток определяют согласно шкале: символ ++ означает, что ппоисходит растворение всех клеток. Символ

+ — растворение большей части клеток; символ — растворечие меньшей части клеток; символ — означает, что не происходит раствопения никаких клеток.

Полученные пезультаты испытания показав табл. 1. Ддя сравнения испытание повтопяют. добавляя 2 м буФепного раствора ацетата при величине рН = 4,0 вместо указан bIx выше ппозрачных ферментных растворов.

В испытании, проведенном для сравнения, не наблюдается раствопения клеток.

П и и м е р 6. Суспензии клеток в физиологическом водном соляном раствопе ппиготавлчзают из культуп Candida utilis IFO-0396, R."-charomvc гerevisiae IFO-0209 и Hansin ul ie a noma lie IFO-0122. каждую из которых

Ilo;Iv÷aioò путем выращивания со взбалтывакием микроорганизма в жидкой питательной спеце, содержащей. вес. О/О .. глюкоза — 3; (ХН;1 8Π— 0,8: КН РΠ— 0.5: NaC1 — 0,2;

МаЯО. 7Н-Π— 0.2 и дрожжевой экстракт—

О,1 с величиной пН = 5.2. в течение 20 ч при набалтывании посредством вращающегося взбалтывателя (скорость вращения

200 об/мин) .

Одну калл п каждой суспензии клеток, приготовленной таким образом, помещают на ппедметнос стекло, и одн каплю ппозпачного р аствоп а сложного фермента Pellicul aria са. ;i!. данного в примере 1. добавляют к одной капле суспензии клеток на предметном

503532

Таблица 1

Природа клеток, подвергаемых растворению

Добавление фермента

PellicuIarIa PellicuIaria

sasakii gramineum

Pellicufaria

fIlamentosa

Добавлен

Не добавлек

Aspergillus niger

Penicilfium steckii

Добавлен

Не добавлен:

Добавлен

Не добавлен

Sacchoronmyces cerevisial

Добавлен

Не добавлен;

Добавлен

Не добавлен

1 +

Добавлен

Не добавлен

Добавлен

Не добавлен.

Добавлен

Не добавлен:

Добавлен

Не добавлен

Добавлен

Не добавлен

Таблица 2

Микроорганизм, подвергаемый растворению

Добавление фермента

15 30 60 90

Добавлен

Не добавлен

Candida utilis

+++

Добавлен

Не добавлен

Saccharomyces cervisae

+++

Добавлен

Не добавлен

Hansenula anomaIa

+ -,—

Candida utiIes

Candida aIbicans

Candida lipoIytica

Lentinus edodes

Bacilfuz subtilis

1.actobac Ilus Iactis

ChIorella pyrenoidosa стекле. Эти жидкие капли быстро перемешивают друг с другом и затем их покрывают покрывной стеклянной пластиной. Это предметное стекло помещают в комнатные условия при 30 С и изменения клеток в жидкой массе на предметном стекле наблюдают под микроскопом в течение определенного периода времени. Эти клетки постепенно растворялись с течением времени.

Степень растворения клеток определяют соответственно следующей шкале: символ + означает, что происходит растворение стенок

Пример 7. В коническую колбу емкостью 300 мл помещают 20 г отрубей пшеницы, 0,5 r порошкообразного высушенного гриба шляпочного (Cortinellus shutake) и 16 мл 5%ного водного раствора сульфата аммония и содержимое этой колбы нагревают и перемешивают, в результате чего получают однородную пастообразную смесь. Эту питательную среду стерилизуют путем обработки паром

Степень растворения клеток ферментами клеток; ++ — растворение клеток ускоряется; +++ означает, что растворение всех клеток завершается; символ — означает, что никакого изменения с клетками не прои"ходит.

Результаты испытания представлены в табл. 2. Для сравнения проводят дополнительное испытание, добавляя одну каплю буферного раствора ацетата с величиной рН = 4,0

10 вместо одной капли ферментного раствора.

При проведении сравнительных испытаний никакого растворения клеток не происходит.

Степень растворения клеток микроорганизмов с течением времени, мин при 120 С в течение 20 мин. Исходную культуру Pellicularia filamentosa инокулируют на

15 стерильной питательной среде, и выращивание в твердом состоянии осуществляют при 25 С в течение 144 ч. Получаемую культуру перемешивают с 80 мл деионизированной воды, и смесь перемешивают при комнатной темпера«0 туре в течение 1 ч с тем, чтобы сложный фермент, полученный из Pellicularia filamentosa, 503532

14 экстрагировался в жидкостный слой. Далее смесь фильтруют под давлением и фильтрат выпаривают, в результате чего получают

65 мл прозрачного раствора, содепжащего сложный фермент. К раствору добавляют сульфат аммония до достижения степени насыщения 70 /о, происходит осаждение сложного фермента. Осадок фильтруют и выглшивзют. в результате чего получают 1,7 г ферментного препарата в виде порошка.

Ферментный препарат растворяют в буферном растворе ацетата с величиной рН = 5,0. получая ферментный раствор, содержащий

l о/О указанного ферментного препарата. 10 мл ферментного препарата помещают в изогнутую трубку в виде буквы L, и 1 г высх шенных дрожжей (д1>ожжи представляют собой разновидность Candida, которые инкубируют, используя питательную среду, содержащую фракцию парафинового углеводорода нефтя- 20 ного дистиллятного масла в качестве источника углерода) или 1 г высушенной хлореллы дополнительно помещают в 1-образную трубкх. Трубку встряхивают при постоянной температуре 40 С, в результате чего ферменты 25 химически реагируют с клетками дрожжей

Таблица 3

Содержание веществ, выделяемых из клеток,мг

Микроорганизм, подвергаемый растворению

Добавление фермента

Время реакции, ч

Сахар

Протепны

Высушенные дрожжи

Добавлен

70,2

75,4

5„7

5,6

30,3

34,1

0,4

0,4

291,0

368,2

95,1

95,4

162 2

198,9

40,1

40,6

Не добавлен

Высушенная хлорелла

Добавлен

Не добавлен

Пример 9. К 100 г высушенных клеток дрожжей Candida lipolytica добавляют 1 л водного раствора (рН = 5,0) ферментного препарата (концентрация 0,5 ), который получают в примере 1.

Смесь выдерживают при 35 С в течение

30 мин, в результате чего протекает фермеитативная реакция, реакционную смесь затем смешивают с 1 л 0,2 н. раствора гидрата окиси натрия.

Затем смесь нагревают при 50 С в течение

30 мин для того, чтобы протеин дрожжевых клеток экстрагировался в водную фазу.

Водный экстракт центрифугируют с Heëüòo удаления уплотненных клеток и величину рН всплывшего слоя раствора доводят до 4,0 путем добавления 6 и. соляной кислоты, проте45 ин осаждается при изоэлектрической точке.

Количество осажденного и извлеченного протеина соответствует 76% от общего содержания протеина дрожжевых клеток.

Пример 8. На данном примере показано, что сложный фермент, соответствующий изобретению, используется для предотвращения порчи различных пищевых продуктов и напитков таких, как томатный, картофельный и апельсиновый соки.

Порции по 10 мл томатного, картофельного или апельсинового сока помещают в небольшие сосуды. Одновременно энзим, полученный по примеру 1, очищают при помощи ионообменной смолы. 0,1, 1 и 10 мг конечного очищенного энзима добавляют в указанные сосуды. Несколько сосудов, содержащих продукты или напитки, оставляют без добавления энзима в качестве контроля. Сосуды выдерживают на воздухе при 28 С в течение некоторого врсмени и затем наличие загрязнения проверяют наблюдением обесцвечивания вида и запаха соков.

Результаты испытаний показаны в табл. 4 (символ + обозначает загрязнения, символ— отсутствие загрязнения), или хлореллы, так что происходит лизирование стенок клеток. По прошествии 1 ч или 3 ч реакции к реакционной смеси, находящейся в изогнутой трубке, добавляют 3 мл водного раствора гидрата окиси натрия, повышая величину рН до 7. Смесь снова встряхивают еще в течение 15 мин и цеитпифмгир .ют для удаления из нее твердых Bc шеств. Получаемый прозрачный раствор аиализирхют на содержание сахаров и протеипов. которые выделяются из клеток. Коли е"тпо сахаров определяют колориметриче.ким !>ïoñoáoì при длине волны света 530 ммк, используя в качестве проявляющего агента 3,5-динитросалициловую кислоту, и содер>канне сахаров выражается в количестве глюкозы. Количество потеинов рассчитывают, определяя содержание азота в протеинах при помощи известного способа Кьендаля-нингидрина, и умножая найденное содержание азота на 6,25.

Результаты испытания показаны в табл. 3.

Для сравнения эту процедуру повторяют, добавляя 10 мл буферного раствора ацетата с величиной рН = 5,0 вместо упомянутого выше ферментного раствора.

503532

16

Таблица 4

Время, день

Содержание энзима, мг/10 мл

Продукт

Томатный сок

0,1

0,1

0,1

10

Картофельный сок

Апельсиновый сок

60.2 35

В случае, когда эту процедуру повторяют, минуя использование ферментного препарата, то количество осажденного и извлеченного ппотеина соответствует лишь 15% от общего соепжания ппотеина дпожжевых клеток.

П и и м е р 10. 10 r корма, состоящего из высушенных клеток Candida utiils, добавляют к 100 мл водного раствопа (OH = 6.01, со,пепжащего 0,5% фепментного ппепарата, котопый получают по лпимеру 3. Эту смесь вы. епживают ппи 35 С в течение 1 ч, так что

Ъепменты химически реагируют со стенками

<.ездок дрожжей. Далее пеакционнчю сме ь

" шивают при темпеРатуре ниже 0 С, в пе" ." -тате чего получают попошкообпазный кпм. cocTOBIIIHA из обпаботанных фепментов ожжей Candida. Этч ппопедчрч повтопяют без использования фепментного ппепапата, н пезчльтате чего получают попошкообпазный

KoDMoBoH продукт, состоящий ппо то из вычшенных при температуре ниже 0 С дпожжей

Torul а. Исходные необработанные высчшенные дпожжи Candida, обпаботанные фепментом дпожжи Candida н ноосто высчшенные ппи темпепатчпе ниже 0 С дрожжи обпабатывают пепсином с целью определения их способности пеоеваоиваться.

Ниже ппиведены данные по спо обности пеневапиваться пепсином обпазпов, %:

Высчшенные необработанные ппожжи Candida (сравнитель1- ый ппимеп 58,4

Яы чп1 »ble ппи тнмпепа" ни>- 0 С пожж» Candida (срав янтельнь|й ппн""ео1

Дпожжн СапЖдя. обпаботанные г.пожнЫм д -" oM, COOTBeTCTBVюшим нзобпет нчю 97,7

П и и м е и 11. V позпачномч и .твопч, со- 40 депжащему сложный фермент Pellicularia sasakii, полчченный по ппимепу 5, добавляют двукратный объем ацетона. в пезчльтате чего выделяют сложный 4»епмент. Осадок собиПают и высушивают, н результате чего получают 45 порошкообразный ферментный препарат. 20 г влажной спекшейся массы (содержание твердого вещества 48 вес. %, состоящей из клеток

Candida utilis, добавляют к 100 мл водного раствора (рН = 4,0), содержащего 1% указанного порошкообразного ферментного препарата. Получаемую смесь осторожно встряхивают при 35 С в течение 1 ч, в результате чего протекает ферментативная реакция. После этой реакции реакционную смесь центрифугируют, удаляя оставшиеся твердые вещества. Всплывший на поверхность слой раствора лиофилизируют, в результате чего получают

7,8 r сухого порошкообразного экстракта растворимого внутриклеточного вещества клеток

Candida utilis. В резчльтате анализа обнаружено, что этот порошкообразный экстракт содержит, %: сырые протеины 54,3; сырые масла 4.0; сырые волокнистые матепиалы 1,7: зола 6.4 и растворимые азотистые вещества 33,6.

Процедуру повторяют с добавлением 100 мл б ферного раствора ацетата с величиной рН = 4,0, вместо ферментного раствопа, получают лишь 1,7 г сухого порошкообразного продчкта после лиофилизации всплывшего на поверхность слоя раствора.

Пример 12. Инокулчм Candida albicans патогенных доожжей пп™г а»янч от путем

nDHRHBKH KvJlhT пы на скоше но 4 агапе этих дрожжей к 100 мл каптойеьно-глюкоаной среды. инкчбипования при 30 С н е ение 24 ч и последчюшего пазбавпения этой пепы водой до получения объема, который в десять паз ппевышает исходный объем. Попции ппиготовленного таким обпазом инокчлчма объемом 1 мл, содержащие 6 х 104 копоний клеток лпожжей на 1 мл. добавляют к попциям по

10 мл картофельно-глюкозной среды (nH =

= 6,01, содепжащей 0.5; 1.2: 4: 8: 16 и

32 мг/мл фепментного ппепапата Pellicularia

sasakii. »олчченного по ппимепч 1. соответственно. Инокчлипованн о спед кчбипчют н стационапных условиях ппН 35 C в течение

24 ч и после этого оппе>еляют количе"тво лизированных клеток Сап4Иа lhicап П >. лученные результаты представлены ниже.

503532

Содержание ферментного препарата в инкубированной среде, мг)мл

Число клеток колоний на 1 мл среды

Активность =- (Л) — 1000, 150 () Таблица 5

Свойства сложных ферментов, полученных из Pellicularia sasakii

Оптимальная температура, OC

Величина активности, мк г/г

Оптима л ьная величина, рН

Ферментативные активности

Активность в отношении ли зирования стенок клеток

Целлюлаза

210

30 — 40

5 — 7

17,0

12,0

40 — 50

40 — 50

5,0

5,0

4,0 — 5,5

3-1,3-Глюканаза

Хитиназа

Таблица 6

Свойства сложных ферментов, полученных из Pellicularia filamentosa

Оптимальная температура, Ос

Величина активности, мкг/г

Оптимальная величина рН

Ферментативные активности

5 — 7

17,2

12,0

Лизирование стенок клеток

Целлюлаза, -1,2-Глюканаза

Хитиназа

30 — 40

40 — 50

40 — 50

5,0

4,0 — 5,5

Отсутствует 2Х10а

0,5 1 К 10

1 7) 104

2 4)(10

4 2X10г

8 0

16 0

32 0

Пример 13. Определяют ферментативные активности сложных ферментов, которые получены из культур Ре111сп1аг1а sasakii u

Pellicularia filamentosa по способам, описанным в примерах 4 — 2, соответственно. Определение ферментативных активностей осуществляют следующим образом. (i) Активность целлюлазы б мл ферментного водного раствора (рН =

=4,0), содержащего 1% ферментного препарата (сухое порошкообразное состояние) помещают в е -образную трубку и в раствор, находящийся в этой трубке, погружают 2 кусочка фильтровальной бумаги (1 см)(1 см).

Этот раствор встряхивают при 40 С посредством встряхивателя, совершающего возвратнопоступательное движение. Измерение осуществляют до тех пор, пока вся фильтровальная бумага полностью не разрушится. Активность целлюлазы рассчитывают согласно уравнению где Х означает время (мин), продолжающееся до тех пор, пока кусочки фильтровальной бумаги полностью не разрушаются; Y— объем (мл) используемого ферментного раствора.

5 (ii) Активность Р-1,3-глюкозы

0,5 мл раствора ламинарина концентрации