Способ проведения ферментных реакций

Способ проведения ферментных реакций

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

-1 1

ОП ЙСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕЙ ЙЯ

Сеев Советских

Социаяистимеских

Ресяубник (14: 504503

К AATRHTУ (61) Дополнительный к патенту (51) M. Кл.

С 129 (22) Заявлено 25.01.74(21) 1992113/28-13 (23) Приоритет (32) 26.01.73

16еудэрстееаныЯ хеммтет

Coaata Mwacrpaa СССР ао делам хзебрвтенеЯ в втхрмтмЯ (31) 19642-А/73 (33) Италия (43) Опубликовано 25.02.766юллетень № 7 (53) Д < 577.15.02 (088.8) (45) Дата опубликования описания, 30,04.76

Иностранец

Эральдо Антонини (Италия) (72) Автор иаобретения (71) Заявитель „ностРаннаи фиРма

"Снам Прогетти ф.п.А.и И.С.ф.Сочиета Пер.Аэиони (Италия) СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ РЕАКБИИ

Изобретение относится к медицине.

Известен способ проведения ферментнь;х акций, заключающийся в том, что водный аствор фермента подвергают контакту с Водным раствором субстрата.

С целью повышения вы.хода целевого про-1:,. (дукта в случае, когда субстрат незначитель но растворим в воде, субстрат растворяют в органическом растворителе, не смешиваю-:

Л ,"UJBMcs с водой.

Как известно, раньше энэимные реакции

:проводили только в водной среде. Дальней;шие исследования в этой области обнаружи-: ли возможность проведения энзимных пре;врашений, не растворимых в воде, посредством работы в водно-органических двухфазных. системах, характеризуемых тем, чт6 органический растворитель (не смешиваю:щийся в воде) является .хорошим раствори- ,.телем для субстрата, по этой причине энзим проявляет действие в соответственной для, него водной окружающей среде, причем не- посредственное цс.йствие со стороны раство рителя при этом прекращается.

В качестве пригодных для применения ,органических растворителей можно рекомен довать следующие: сложные эфиры карбоно вых кислот, имеющих 2-15 атомов углеро«

g да, простые алкильные эфиры спиртов, имекьщих 4-10 атомов углерода," сложные алкильные эфиры спиртов, имеющих 4-10 атомов лерода; алифатические, ароматические и циг. лоалифатическиеуглеводороды, галоидзамешейgp. ные углеводороды.

Пример 1. 5 мл этилацетата, со, держащего 10 мг/мл эстрадиола (3,6 х

-2 õ 10 . М), эмульгируют с равным объемом

15 ацетатного буфера 0,1 М (pH=5.4)i содерf

Ъ

-6 ,жвщего 0,060 мг/мл(10 М} лакуаэы.

Смесь инкубируют при температуре о еп,25 С при перемешивании, причем в газовой å содержится,чистый кислород или воэ-!

1дух. Через различные промежутки времени отбирают 5 мл органической фазы и исполь, эуют для анализа эстрадиола и возможных

Q5 продуктов.

504503 вый эфир, дихлорэтан) могут служить заменителями для этилацетата.

Пример 2. 3,2 мл фосфатного буфера, 0,2M: при рН 7,6, содержащего 2,5 мл

И АД и О, Î5 Н Я Д Н единиц эмульгируют с 3,2 мл органического растворителя, со-2 держащего 13 мг тестостерона (Д <4 х 1 0 М )" о при температуре 22 С.

Источником энзима является очищенный еизим из жидкой среды, получаемой при культ вировании грибков РоВУрогпв оегвьсобф

Через 4 час:. при указанных выше усло»

Ьиях проведения реакции- половинное количество эстрадиола превращается в продукты, которые могут быть различены с помощь|о. хроматографического анализа. При аналоГи ных испытаниях, проводимых в отсутствии органического растворителя, при пасы- (9 цении:эстрадиолом ацетатного буфера, коI <, вторый содержит лакуазу, было невозможно доказать наличие реакций с применением обычных методов, Несколько других органических раство- р рителей, (например тркхлорэтан, диэтилоСмесь церемешивают со скоростью 100 качаний в 1 мини через разйЫчные промежут ки времени определяют оптическую плотность водной фазы при 340 пт.

Данные определения оптической плотнос ти представлены в табл,1, Таблица 1.

Оптическая плотность:. при 340пщ через

Органический растворитель

2 часа

22 часа

1,4

Этилацетат

Бутилацетат

Этиловый эфир

Бутанол

3,4

1,3

3,2

1,2

0,,55

} . 30

В случае отсутствия органического рас-, - методу тонкослойной .хроматографии с притворителя, общее возрастание оптической; менением в качестве средства для элюироплотности при 340 пй ограничивается рас-, вания системы этилацетат-бензол — н,гектворимостью тестостерона в воде (насыщен сан (100: 80: 60). ный раствор, содержит 25-30м/мл теЖосте «В Стероиды экстрагируют с подложки— рона), Таким образом, при отсутствии орга" i носителя .хлороформом;в течение 24 час > ,нического растворителя, значение оптической, : при комнатной температуре, плотности никогда не пРевышало),„примерно, После испарения хлороформа стероиды

0,3. анализируют с помощью спектрофотометра

П р и M e p 3, 3 мл 6УфеРного Раат- Ю пРи 240 в сРеде этанола., вора, содержащего окисленный КО-фактор Источником энзима является гидроксо и пируват натрия, смешивают с двумя сво- ст .роид дегидрогеназа (НБДН) из клеток бодными энзимами L LlH или Я АДН. К вод- Рчепботоп ав 1е51оз1егоп а сеВе ному раствору добавляют равный объем ор- лактик дегидртеназа (ДЯ) фирмы Берин ганической фазы, содержащей стероид, и 45 гер. осуществляют эмульгирование двух фаз Пример 4. 5 мл раствора энзима

Реакцию проводят при встряхивании реак- .встряхивают с 2,5 мл оливкового масла ционной смеси при 90 качаниях в 1 мин. ! растворенного в 2,5 мл дихлорацтана, и

Затем развитие отдельных реакций уз- темперируют при 37 С в течение 1 час при нают, определяя количества конвертирован Ж .перемешивании. ного и неконвертированного стероидов, ко-, Через определенный промежуток времеторые присутствуют в органической фазе, ни добавляют 30 мл смеси равных частей

В заданные моменты времени фазы сме- ацетона с этанолом, затем растирают с шивают, отбирают точно определенный объ- 0„05М углекислого натрия. ем органической фазы и определяют содерЯ

Результаты испытаний представлены в жание тестостерона и андростендиона по табл. 2.

504503

Таблица 2.

Испытание без эмульсии, без раствори;ел я

Испытание с растворителе м, Липаза, мг моли жирной кислоты, выделившиеся о эа 1 час прн 37 С

97

206

14,4

2S,8

280

310

43,2

400

439

57,6

Испытание 2.. Далее испытание прово дят с бенэолом.

° 20

Для этого такую же реакционную смесь, 1 .как при испытании 1, инкубируют совмест ;но со смесью 5 мл бутайоле и 5 мл бено

:зола при перемешивании при 20 С.

:Результаты испытаний сведены в табл.3 ,Таблица 3.

:.Оптическая плотность-при 340 птв

Время,: мин,! .

Испытание 1 Испытание 2

0,190

0,190

3,80

3,85

5,30

4,95

9,60

60

12,6

9,4

15,0

10,3

16,3

11,4

180

17,5

11,7

300

1320 12,2

Формула изобретения 4б

Способ проведения ферментных реакций путем контакта водного раствора фермента и раствора субстрата, о т л и ч а ю—

Составитель Т. Серебренникова

Г

ТехредА. Демьянова Корректор Л. Тромболе

Редактор A. Бер

Заказ 110

Тираж 551 Подписное

ПНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035,Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

Пример 5. Жпытание 1.

Составляют реакционную смесь иэ 10мл полифосфатного буфера (О,IМ, рН=9), в котором растворяют следуюшие вешества: 12,5 мг семикербаэида, 16,7 мг глицина,,3 Ы восстановленного глютатиона, 30 мг фАД. Смесь инкубируют совместно с 5 М бутаноле при перемешивании, 20,4 ш и и с я тем, что, -. целью повышения выхода целевого продукта в случае, когда субстрат незначительно растворим в воде, ;субстрат растворяют в органическом раст ворителе, не смешиваюшемся с водой.