Способ получения антибиотика

Способ получения антибиотика

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

. те т, -.б F, n м о . .5. М F-.1

Союз Советских

Сощиалисти чески х

Республик

| 5 9246

К ПАТЕНТУ (6l) Дополнительное к патенту (22} Заявлено 21.01.74 (21) 1994489/28 — 13 (23) Приоритет — (32) 22.01.73 (31) 325264 (33) CI!IA (43) Опубликовано 30.03.76. Бюллетень №!2 (45) Дата опубликования описания 20.07.77 (51) M. Кл.

С !2 D 9/00

Гасударстееннвй иамитет

Савета Ииииетраа СССР . па делам изобретений и етирытий (53) УДК

615.779.9 (088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Роберт Л, Хамилл и Вильям Макс Старк (США) Иностранная фирма

"Зли Лилли энд Компани" (71) Заявитель (CI1IA) (54) СПОСОБ ПОЛУЧБНИЯ АНТИБИОТИКА

Изобретение относится к микробиологической промышленности.

В доступной патентной и специальной литературе описания способов получения антибиотика с использованием указанной культуры найдено не было.

Предложенный способ получения антибиотика заключается в том, что культуру Acti ncp lanes

utahenesis ЯНВ1 5614 выращивают на среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические. .соли, с последующим выделением и очисткой целевого продукта и разделением на активные компоненты известными приемами.

Предлагаемый антибиотик включает два пептидных активных компонента А и 8. Эти компоненты структурно связаны друг с другом и проявляют химические, физические и спектральные свойства, аналогичные дпя пептидов. Компоненты сопутствуют ферментации и получаются в виде смеси. Их отделяют друг от друга и изолируют, как индивидуальные соединения.

Смесь активных компонентов А и В предсивляет собой белую пудру, растворимую в воде и низших спиртах, ио нерастворимую в большинстве органических растворителей.

Активньй i.oìïoíåíò А — белое аморфное соединение, не расплавляемое при температурах ниже 220 С. Элементарный анали з, %: углерод

44,98, водород 6,15, азот 10,28, кислород 26,37, остальное 4,14. Компонент А имеет молекулярный вес около 1500 определенный в метаноле осмомет7 рическим методом.

Компонент А абсообируется я у>.ьтрафиолетовом района спектра и псказьиает максимумы абсорбш1и в всде при Хь:«c 2 0тм (>- 9,500; уступ) и 273 тм (Х 2,700}; в осп.-:ланки или кис лоте изменения не происходит, Актив ный компонент  — белое аморфное соединение, не имеющее отчеттивой точкч нлавлео ния, но обугливающееся при теьаиратуре -200 С.

Элементарный аныиз„%; углерод 49,96, водород

6,98, азот 9,90, кислород 23,86, остальное 4,66.

Молекулярный вес компонента В -2800, определен в метаноле осмометрическим методом, Компонент В абсорбируется в ультрафиоле. тсвом районе спектра и показывает абсорбционные максимуьпт в воде при Хмакс 220тм (Z 9,200; уступ} и 273 тм (Х 3,200}: в основав и или кислоте изменения не происходит.

509246

Смертельных. случаев не было при оральном введе- е зр

Электрометрическое титрование показывает постоянный расход основания, что является отличительной особенностью циклических пептидов. ,.Компоненты А и В и их смеси значительно растворимы в воде и в таких низших. спиртах-,.как; бутанол и метанол. Они нерастворимы в большинстве органических растворителей таких как, например, диэтиловый эфир.

Антибиотик и его активные компоненты предотвращают рост микроорганизмов, патогеничных к животным и растениям. Кроме того, антибиотик и его компоненты 1эбладают пвотивопаразитным и ускоряющим рост действием.

Антибиотическая смесь и компоненты особенно действенны против патогенических грамм-положи тельных бактерий, как вне, так и в организме, и могут использоваться для лечения и контроля заболеваний, вызываемых этими бактериями. . Активный компонент В в минимальных количествах присутствует в анп биотической. смеси.

Активность компонентов А и В вне организма совершенно одинакова. Таким образом, разделение этих двух компонентов, используемых при обработке и контроле болезнетворных организмов или в качестве ускорителей роста, не является существенным.

Острота токсичности антибиотика, определенная при внутрибрюшинном введении мышам и выраженная как I- s о составляет 1370.мг/кг, лии мышам 1250 мг/кг антибиотика.

Против омикробное действие антибиотика в организме наблюдают при его введении мышам или парэнтерально или орально.

Полезным свойством антибиотика является erg. способность улучшать ростовую характеристику животных. При добавлении к пище растущих цыплят 45,4г на 1 т корма средний весовой прирост после 10 дней составляет 159,9 г, по сравнению со средним весовым приростом 146,1 г для контрольной группы. Способность антибиотика стимулировать весовой прирост делает его особенно полезным дня увеличения продукции животноводства. При использовании его в качестве ускоряющего рост агента можно применять соответствующие концентрации антибиотика в нормальном пищевом рационе животных. Антибиотик эффективен как ростоускоряющий агент при введении животным в дозах от 10 до 1 0 r на 1 т пищевого рациона.

Антибиотик является противопаразитным агеатом, в особенности эффективен против рецидивной лихорадки, вызываемой спирохетой Borrel ia novyi, при парэнтеральном введении в примерной дозировке от 10 до 500 мг/кг.

Антибиотик может быль использован как поверхностный дезинфектант. Растворы, содержащие два процента антибиотика, являются эффективными для целей дезинфекции. Такие растворы, содержащие также детергент или другой очищающий агент, являются полезными для дезинфекции стеклянных изделий, зубных и хирургических инструментов, а также стен, полов и столов в помещениях, где важно поддерживать стерильные условия, т.е. в госпиталях или помещениях для приготовления

НИЩИ.

Новый антибиотик получают путем выращивания производящего штамма из Actinoplanes организма в условиях аэробного погружения в соответствующей культуральной среде, Антибиотики извлекают с помощью различных обычно иснользуемых и известных методов выделения и очистки.

Микроорганизмом, пригодным, для приготовления антибиотика, является разновидность класса

Actinoplanes, семейства Actinoplanaceae, порядка

5. Actinornycetaies

Приюдйая для-ироиэводства ущибиотика 1сультура Actinoplanes хранится в коллекции культур

Северного отделения прикладного исследования и развития Министерства сельского хозяйства США, Пиория, Иллинойс 61604, известна под номером

NRR1 5614.

Культура, производящая антибиотик, классифицирована как новый штамм Actinoplanes utahenes is Couch.

5 Морфойогия.

Вегетативный мицелий, Гифа на синтетической и нолусинтетической агаровой среде является длинной, разветвленной,-разделенной перегородкой и имеет от 0,2 до.4,2 мкм в диаметре;:На поверхностц агара мицелнй образует компактный, слегка поднятый и иногда похожий на кожу рост. Воздушные тифы не образуются на любой среде. Вертикальные тифы в изобилии находятся ниже поверхности агара. Каждая вертикальная гифа берет начало из горизонтального слоя гиф, который в изобилии находится более глубоко в агаре и заканчивается на поверхности arapa с образованием спорангия, Спорангий, В изобилии образуется на агаре

Чапека. Появляется после семи дней инкубации при

4р 22 — 25 С. По мере роста вся поверхность колонии покрывается плотной спорангиальной подстилкой.

Спорангий рождается разрозненно на очень коротких спорангиоспорах (концевая часть вертикальных гиф над агаровой поверхностью). Иногда спорангийоспоровые ветви дают начало вторичному или, редко, третичному спорангию. Спорангий обычно имеет сферическую или субсферическую форму и может быть до 8 — 10мкм. Он содержит -35 — 50

I спорангиоспор, которые расположены в одном или более выпуклых кольцах в спорангии, При зрелости спорангиоспоры имеют диаметр -1,0 мкм. Спорангиальное раскрытие всегда появляется при общем измельчении спорангиальной стенки. Процесс высвобождения спор обычно начинается спустя 10 или 15 мин после помещения спорангия в воду.

Обычно споры не становятся подвижными сразу, но становятся активно подзиждыми при действии пучка полярной флагеллы в течение -5 мин.

На агаровом растворе Чапека. Хороший рост, р точечный.прививочный материал в течение 4 недель

509246 дает колонию в диаметре около 1 см. Воздушные гифы не наблюдаются. Колония обычно имеет незначительное центральное поднятие. Цвет колонии вначале ярко — оранжевьй и становится тускло — оранжевым, когда образуется спорангий и покрывает мицелий.

Пептоновый агар Чапека. Прекрасный рост; точечньй и прививочный материал в течение 4 недель дает колонию диаметром около 0,5 см. Воздушные гифы не наблюдаются. Колония обычно ровная, рассеянная и слегка слизистая. Цвет колонии тускло — коричневатьй, оранжевьй. Спорангий не производится.

Anio — Henssen агар. Прекрасньй рост; точечньй прививочный материал в течение 4 недель дает колонию диаметром около 0,5 см. Воздушные гифы не наблюдаются. Колония является гороподобной, имеющей острую вершину. в центре с острыми гребнями, выдающимися к краям колонии. Цвет колонии от ярко — оранжевого до желто-оранжевого. Спорангий образуется в большом числе в старой части колонии, но не до такого размера, как при образовании на растворе агара, Химический conas системы клетка — стенка, Клетка — стеиочный химический состав Actinoplanes utahenesis NRRL 5614 подобен штаммам

Act inop lanes utahenes is.

Actinoplanes utahenesis NRRL 5614 может расти в культуральной.среце с получением антибиотиков:

Культуральная среда может быть любой из ряда известных, однако для экономии продукции, максимального выхода и легкости выделения антибиотиков предпочтительной является определенная культуральная среда. Одним из предпочтительньж источников углеводов является патока, источников азота —. соевая мука.

В культуральную среду должны быть введены питательные неорганические соли, которые представляют собой обьтчнь1е соли, способные приносить натрий, калий, аммоний, кальшй, фосфат, хлорид, сульфат, ацетат и карбонат. Кроме того, вводят такие источники ростовых факторов, как барду и дрожжевые экстракты. В культуральную среду для . выращивания Actinop lanes sp.. включают и сопутствующие элементы, Начальное значение рН культуральной среды может изменяться. Однако перед прививкой с организмом доводят рН культуральной среды до 6,8 и 7,5 в зависимости от конкретной используемой среды. Конечное значение рН определяется начальным значением рН буферных веществ, присутст. вующих в среде, и периодом времени, в течение которого организм может расти.

Для производства значительных количеств антибиотика используют затопленную аэробную ферментацию в резервуарах. Малые количества антибиотика получают из культуры во встряхи. ваемой склянке. Вегетативную прививку осущест-, вляют путем прививания малого объема культуральной среды со споровой формой или фрагмен5

30 зь40

60 тами мицелия организма для получения свежей, активно растущей культуры организма, Затем вегетативную прививку переносят в больший резервуар.

Используемая для выращивания вегетативной прививки среда может быть такой же, как и используемая для больших ферментаций, но может быть использована и другая

Антибиотик, производящий организм, может выращиваться при 20 и 35 С, оптимальная температура около 30 С, Стерильньй воздух продувают через культуральную среду. Для производительного выращиванияя организма и антибиотиков объем используемого в резервуаре воздуха составляет более 0,1 объема воздуха в минуту на объем культуральной среды. Оптимальньй рост происходит при объеме используемого воздуха между 0,6 и 1,0 объемами воздуха в 1 мин на объем культуральной среды.

Производство антибиотиков контролируется в течение ферментации путем исследования образцов бульона на антибиотическую активность против организмов, известных своей чувствительностью к антибиотикам. Одним из испытательных организмов является Багсяа lutea АТСС 9341.

Максимум производства антибиотической активности достигается в период от 20 до 94 час.

Антибиотическая активность во время ферментирования производящего организма имеет место в антибиотическом бульоне. В соответствии с этим используемые в производстве антибиотиков методы вьщеления выбирают для обеспечения максимального извлечения антибиотиков из бульона, Поэтому, например, мицелий и нерастворимые твердые ве1цества удаляют из ферментационного бульона обычными способами, (фильтрацией), а антибиотики удаляют из отфильтрованного бульона экстракцией или абсорбцией.

Штамм Actinoplanes NRRL 5614 производит антибиотический компонент А, как преобладающий компонент, Компонент А составляет примерно от 95 до 98% общей извлеченной антибиотической активноспа Компонент В составляет остаток антибиотической активности.

Низшие спирты, такие как бутанол и центанол, являются подходящими растворителями для экстрагирования профильтрованного бульона. Дальнейшая очистка антибиотика включает дополнительные операции экстракции и абсорбции. Для этого с успехом могут быть использованы такие абсорбтивные материалы, как Sephadex G = 25 или

6 = 50, или алюминий.

Активные компоненты А и В отделяют друг от друга и выделяйт в качестве индивидуальных соединений с помощью известных методов — противоточным распределением, препаративной тонкослойной хроматографией или колонной хроматографией.

Предствителями адсорбентов для колонной хроматографии служат: алюминий, элюирующий фактор В с метанолом и А с 2 o-ным аммонием в метаноле; ДЕАŠ— целлюлоза при градиентном

509246

Уклон прививают с Actinoplanes utahenesis

NRR1 5614 и выращивают при 30 С от 10 до14 дней. Полученный в мицелии пигмент изменяется от оранжевого до оранжево — коричневого. Культура не нормально опорилировала на этой среде; поэтому необходимо вымочить мицелиальный мат ровн1эй заостренной прививочной иглой, чтобы увеличить число потеы иальвих центров роста. Размоченную созревшую культуру покрывают стерильиой водой и осторожно скоблят стерильным прутом для полумиия мицелиальной суспенэии. Эту суспенэию .сохраняют лиофилизацией. 1/6 часть приготовленной уклонной культуры используют для прививки

5Q мл вегетативной среды следующего состава {r):

Овсишка (предварительно сваренная) 20,0

Триптон 5,0

Сухие дрожжи 2,5

Деиониэированная вода 1 (л) .

Начальное значение рН вегетативной среды пркблизительно 7,2; после 72 час рН составляет

-6,6 — 7,0. Вегетативную среду прививают. и выращивают в склянке (250 мп) -при 30 С в течение 72 час на ротационном встряхивателе при 250 oi/мин. 50

Конечные твердые вещества составляют 20 — 30%.

Б.Ферментация в резервуаре.

Вегетативную среду (1,25 л), приготовленную как описано выше, используют для прививки 25 л стерильной продуктивной среды следующего соста- 55 ва (г):

Сахароза

Соевьш цвет

Патока

10,0

10,0

30„0 элюировании с 0,001 М до 0,2 М буферным раствором уксуснокислого натрия, рН 5,6; катионообмениая смола (ХŠ— 64 в водородном цикле), элюирование с 0,05 М цитратным буферным раствором с градиентным изменением рН от 5,2 до 5,8.

Противоточное распределение является предпочтительным методом разделения. Хорошие результаты при этом методе достигаются, если одна фаза . является полярным, несмешивающимся с водой растворителем, или растворной смесью, и другая фаза является буферным раствором, имеющим рН в области -5,0 — 8,5. Оптимальные результаты дости. гаются, когда одна фаза является такой растворной системой как, например, мепшизобутилке тон: бутанол или зтилацетат: этанол, а другая фаза является буферным раствором, имеющим рН в области -6,8 — 7,0.

П риме р1.

А. Ферментирование антибиотика во встряхиваемой склянке.

Культуру Actinoplanes utahenesis NRRl 5614 приготавливают и помещают на агарный уклон, имеющий следуюпп и состав: овсянка (предварительно сваренная) 65 r, агар 20 r, деионизированная вода 1 л.

Энэиматиче ский гидролизат казеина

К2 НРО4

Mg ВО4

Oow Corning ant i fcam (антивспениватель)

Минеральная смесь Чапека

Водопроводная вода

4,0

1,0

1,0

0,2

5,0 (мл)

25 (л).

После стерилизации в автоклаве при 120оС в течение 30 мин рН среды равно 7,2. Привитую продуктивную среду помещают для ферментироваиия в течение 5 дней при 30 С в 30-литровый ферментационный резервуар. Ферментационную среду продувают стерильным воздухом со скоростью 1 объем воздуха на объем культуральной среды в мИнуту и перемешивают в обычной мешалке при 400 об/мин.

Пример 2. Выделение активных компонентов.

Активные компоненты А и В разделяют противоточным распределением, используя 15 разделительных воронок (500 мл) с 250 мл каждой фазы и движущуюся нижнюю фазу. Верхней фазой является метилиэобутилкетон:1 — бутаиол (3:2), нижней 0,1 M буферный раствор фосфата натрия с рН 6,8., Компонент А перемещается с нижней фазой, компонент В остается в верхней фазе первой воронки.

Выпаривание под вакуумом дает 0,1 r компонента

В. Коошонент А извлекают из буферной фазы экстракцией с 1 — бутанолом. Бутанольный экстракт выпаривают досуха под вакуумом. Полученный таким образом остаток растворяют в метаноле и вновь используют эфир для осаждения 2,9 r компонента А.

Ферментационный бульон (-25 л), полученный. по примеру 1, профильтровывают с вспомогательным фильтровальным порошком (НуПо Super — cei диатомовая земля), рН фильтрата бульона доводят до 6,5 при разбавлении соляной кислотой, а затем фильтрат дважды экстрагируют с бутанолом. Бутанольный экстракт концентрируют под вакуумом с получением масла. Масло растворяют в буферном . растворе фосфата натрия (0,1 М, рН7,0), и буферный раствор трижды экстрагируют с бутанолом.

Бутанольный экстракт выпаривают под вакуумом досуха Остаток растворяют в метаноле; для осаждения антибиотической смеси добавляют эфир. Осадок отделяют центрифугированием и высушивают в вакууме с получением рыжевато — коричневой пудры (выход из исходного фильтрата примерно 50 —.65%). Этот остаток дополнительно очищают и хроматографируют над S+hadex G - 25 в воде.

После хроматографической очистки активный материал вновь осаждают из метанола с использованием эфира, выделяют, как указано выше, и получают 3 г ипибиотической смеси.

509246

С, „„C.М.

Texpem Н, Андрейчук

Редактор Н. Спиридонова

Корректор С. Шекмар Гираж 574 Подписное

llHHHIIH Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушскал наб., д, 4/5

Заказ 955/504

Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Формула изобретения

Способ получения антибиотики, о тли ч а ющи й. с я тем, что культуру Actinoplanes utahenesis NRRL ,5614 выращивают. на аредв; аодвржащей источники углерода, азота и неорганические соли, с последующим выделением и очисткой целевого продукта и разделением на активные компоненты иэвест. ными нрие мами.