Способ получения антибиотика

Способ получения антибиотика

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

<>5ПО27

ОП ИСАЙ ИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Зависимьш от патента— (22) Заявлено 12.08.70 (21) 1478713/13 (32) Приоритет 12.08.69 (31) 849395 (33) США (43) Опубликовано 15.04.76. Eþ.÷ëe-,е ь М 14 !

45) Дата опубликования описания 29.09.76 (51) М.Кл." С 12 0 9/14

Государственный комитет

Совета Министров СССР ло делам изобретений (53) УДК 615.779.931 (088.8) и открытий 1

l (?2) Авторы изобретения

Иностранцы

Марвин Горман, Калвин Юджин Хиггенс (США) и Рамакришнан Нагараяи (Индия) Иностранная фирма

«Эли Лилли энд Компани» (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА р

I il 3

He- (Сн ) 5— - С вЂ” 3H .)

ОООН

О .. . С11е О

ОООН

Изобретение от1носится к медицинской лромышле,нности. где R — Н или ОСНОВ, в литературе не описан.

Он заключается в том, что культуру Streptomyces clavuligerus ХКК! 3585 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и,минеральные соли с:последующим:выделением целевого продукта в виде основания или соли, известными ,приемами.

Выращивание осуществляют лри 25 — 37 С ,в течение 36 — 72 ч.

В |качестве источника углерода в питательную среду вводят таооие вещества

Предпочтительными являются глюкоза и глицер ин.

В качестве источника азота в среду вводят такие вещества, как соевая мука, кукуруза, мука из семян хлопчатника, мясной или соевый экстра кты, казеи н, смеси аминокислот.

Предпочтительными являются,пептоны, соевая мука, смеси а миноиислот.

Из минеральных солей иепользуют соли

Предлагаемый сиосоо получения антибиотика общей формулы натрия, калия, аммония, кальция, соединения фосфора, сульфаты и карбонаты.

В среду целесообразно включать 1и стимуляторы роста. Первоначальное значение рН среды должно быть 6,5 — 7,2.

Культивирование Streptomyces clavuligerus

3585 осуществляют поверхностным или глубинным способом в аэробных условиях.

Инокулировапие среды осуществляют су"-пеизией спор или культурой в вегетативной форме.

Вегетативную форму посевного материала получают на той же среде, которую используют для культивирования. .Выращивание культуры осуществляют при 25 — 37 С, предпочтительно прои 26 — 30 С в течение 36 — 72 ч .при расходе воздуха в среду 0,2 — 0,4 об/мин на 1 объем питательной среды, предпочтительно 0,4 об /мин.

После выращивания культуры в течеиие трех дней антибиотик выделяют из среды.

Для этого мицелий и нерастворимые твердые

511027

Таблица (Характеристика

А 16886

Наблюдавшиеся свойства

Морфология

15

Характеристика культур по ISP № 2 (агар, содер>кащии дро>к

20 жи и солодовый экстракт) 1SP ¹ 3 (агар с овсяной мукой) 25

1SP № 4 (неорганическая соль— крахма.чьиый

1SP № 5 (глицерино-аспарпшовый агар) 35 Томатная паста— агар с овсяной мукой

40 Агар Эмерсона

Агар Беннета

Агар Чапека

Глюкозо-аспаргиновый агар

С кудн ы и рост.

Тироизииовый агар

Питательный

60 агар

Я блоч но-к и слыл кальций

65 вещества отфильтровывают или центрифугируют, а из фильтрата или фугата антибиотики выделяют методом э(кстракц ии или адсорбцни.

Для адсорбции,используют такие адсорбенты,,как уголь, силикагель, окись алюминия, микрокр(исталлическую целлюлозу или ионнообменные смолы.

Адсорбированный антибиотик или его соль элюируют растворителем. При использовании в,качестве растворителя муравьинокислого аммония или ацетата натрия антибиотик выделяется в виде аммиачной или натриевой соли.

Микроорганизм Streptomyces clavuligerus ,выделяют из образцов:верхнего слоя почвы при суспенд ировани и их в стерильной дистиллированной воде с последующим распределением суспензий на агаре. После посева на агар культуру выдерживают при 25 — 35 С в течение нес(кольких дней. В,конце инкубационного;периода:колон и и микроорганизма, вырабатьпвающего антибиотик А 16886, лереносят стерильной платиновой петлей в косой агар.

Затем его (выдерживают в термостате до образования колоний для,посева в .количестве, достаточном для получения антибиотика

А 6886.

Использованный актиом ицей трудно классифицирозать в роде Streptomyces ввиду не типичной, морфологии. По этой причине микроорганизм считается новой разновидностью и получил название Streptomyces clavuligerus.

Этот вид образует хорошо развитый мицелий из коротких симпоидально разветвленных воздушных пиф. Образуются булавовидпые боковые ветви со спорами от одной до четырех в .каждой. Конидии,в субстрате не оор азуются.

Методом электронной микрографии были обнаружены споры с гладкими стенками. Препараты клеточной стенки содержат 1-изомер диаминопимел(иновой кислоты и глицин, кроме основных cocTBBHblx частей, аспаргиновой и глутаминовой кислоты и аланина. В массе споры серого цвета, а первичный мицелий окрашен от светло-желтого до желтовато-коричневых тонов. Раствор(имый пигмент не образуется. Оптимальная температура 26 — 30 С.

При 37 С роста нет. По морфологии эта (культура (похожа на не(которые штаммы Thermomoi?ospora и (icitomonospora.

Новый микроорганизм хранится в коллекции культур службы агричсультурных исследований министерства сельского хозяйства

США, Пеория, штат Иллинойс, 61604: под № РР 3585.

Характеристика Streptomyces clavuligerus

3585 дана в приведенных ниже таблицах.

В таблицах цифры в скобках означают сер ии цветов Треснера и Бакуса, а также цветовые группы Моерца и Пауле и подчеркнуты таоличные обозначения цвета.

Спорофоры получены па воздушном Illume.чпи и состоят из сети коротких симпопдальио разветвленных гиф.

Ооычио па коротких булавообразHhtx ветвях образуется 1 — 4 споры.

Размеры спор 0.34 — 0,85 Qi 0,85—

1,5 мкм. Средние размеры спор

0,6-! Х 1,5 мкм.

На электронных микрограммах видIIhI гладкостениые споры. Споры ие образуются в мицслии субстрата.

Рост обильный, серовато-желтый ((2I(3); обильный воздушный ми1 целий, темно-серьш (СЗ)b (2(В!); растворпчьш пигмент отсутствует.

Уз:ереиный рост, светло-желтый (I I С!), значительный воздушный мицелий белого цгета (%) в (27А1); растворимый пигмент отci тствч ет.

Обllëüíûé рост, серовато-желтая (12В2): умеренный воздушный

ittп елпй, серый (СУ)2 Fe 1454(); растворимый пигмент отсутствует.

Хороший, рост, светлый желтоватозеленый (IОВI), хороший воздушный мицелий, белого цвета (IV) а; растворимого пигмента нет.

Обильньш рост, серовато-желтый (!!Е4); умеренный воздушньш itttцелиш. светлый, серовато-оливкоIII.tiI !GN, 1 — /,ig (21ВI); раствоpIti ый пигмент отсутствует., Обильный рост, свет.чо-желтый (1 1C1); скудный воздушный мицелий, растворимый пигмент отсмтствмет.

Обильный рост, светло-желтый (1112); обильный воздушный мицелий, темный, серовато-зеленый (ОХ() 24 — /2 ih (23АЗ); растворимый пигмент отсмтствмет.

Умеренный рост, светлый желтовато-зеленый (10В!); хороший возду(цный мпцелпй ((it) b (27ЛI); растворимый пигмент отсутствует.

Умеренньш рост, светло-желтый (10B2); умеренньш воздушный мицелий, желтовато-серый (GI) 2 dc (1ОЛ2); растворимый пигмент отс тств ет.

Хороший рост, светлый, желтоватозеленый (IОВ 1); разбросанный воздушный мицелий, бечьш; ра —,воримый пигмент отсутствует.

Обильный рост, светлый; желтоватозеленый (10Л1); хороший воздушный мицелий, белый (%) а.

511027

Продолжение таблицы

Характеристика

CBOIICTB3

На б,) юда вш неся свойства

Не свертывает, происходит ление над рез 17 дней.

Молоко ссвет

Нит )аты

/Келатин

Не BoccTBII 3Bëèâàåò

Не азж икает.

Реакция роста на изменение рН

Образование меланина

1-!e»j)oIIcõîjuIIT.

Псптоно-железный агар и триптонд1)ожжевой экстракт (Оптимальная тем- пература

Основные компоненты гидролизатя целых клеток.

Соединенсае

Реакция роста

Ут глизация, глерода:

1-Лрабпноза

Рамноза

Фруктоза

Л-Ксилоза

Мелезитоза

Рафииоза .),екстроза

Целобиоза

)1альтоза

Сахароза

Целлюлоза

Инозит з1япит

Глутаминат натрия

50 (+) (+) 55

65 р!1 5,0 — 6,0 оптимальный предел для роста; ири j)1-1 7,5 — 8,5 Ipollczop!I) рост, !о cпоры не образуются.

При температуре 26 — 30 С хороший рост и спорообразование, при

37 С и выше рост не происходит.

1, ) — диамииопимелиновая кислота, глицин, глутамииовая кислота, аспаргиновая кислота, алания и лейции.

B табл. 2 показаны результаты опытов по утилизации углерода, проведенных на организме ККК1 3585. В таблице применены следующие обозначения:

+ — Рост и утилизация — — Рост и утилизация не происходят (+) Вероятная утилизация (†) Сомнительная утилизация.

Таблица 2

Утилизация углерода ARRL 3585

Как указывалось выше, антибиотик А 16886 можно получать,при выращиваниями МККК 3585.

В,качестве тлитательной среды для получения антгибиотиха А 16886 можно,иопользовать различные среды, однако микроорганизм способен использо вать только немногие источники углерада,в и скусственных условиях выращиван ия. Специалистам в этой области извесгно, что микроорганизмы в сложной среде могут иопользовать такие источники углеро10

45 да, которые в искусствеHHblx условиях не используются. Для экономически выгодного получения максимального выхода антибиотика Л 16886 и легкого выделения его прелпочтительно испо 7b30BB Tb простые питательные срелы, такие как гхрахмал глю хозы, глицерин, мелассу, дехстри н и т. п.

При культивировании Streptomyces cl aynligerus ооразуются новые а либиолопичесхпе вещества, названные ависора ми А 168861 и

A 1688611 или факторами 1 или II. Соли э::Ix антибиотиков легко получаюгся при реакции их с соотзетствующими кислотами или основаниями. Антибиотиках А 16886 и его соли оилалают способностью разрушать бактер и!, а тахже .-листо-.онным действием.

Способ получения антибиопика Л 16886 прелусматривает выращивание $1гeptomvces

clavuligerus ХКЯ1 3585 в питательной среде, содержащей усвояемые источциии углерода, азота и неорганичесгхих солей, в аэробных условиях глубинным методом ло накопления в питательной среде значительного количества антибиотика.

Лнтибиот ическое вещество Л 168861 представляет собой первичную амманиевую соль— аморфное, вещество не совсем белого цвета, температура размягчения которого 190—

300 С. С повышением температуры изменяет цвет до темно-коричневого. Легко растворим в воде, мало растворим в низших алканолах и нерастворим в ацетон итриле. Вещество амфотерное и имеющее титруемые группы рК „=41; рК . = 5,2; рК,,„= 9,3; рК „. = 10,5. Молекулярный вес его равен, примерно 530. Примерный со=таз, %: углерод 40,26, водород 5,81, азот 33,37, кислород 7,2. Удельное вращение — (а) г)" + 153,6 (С = 1% вес/объем в воле).

Смесь его с минеральным маслом имеет следующие характерные полосы поглощения в инфр «pacuoH oo IacTII cIIc!Icrpa: 3,10; 5,68;

6,30; 6,60; 7,20; 7,60; 8,33; 9,35; 9,60; 9,85;

11,60; 12,90 ик.н.

Антибиотическое вещество Л )688611 представляет собой аммиачную соль — пушистое аморфное вещество, не совсем белого цвета с температурой размягчения 190 — 300 С, с изменением цвета ло темно-коричневого. Хорошо растворим в воде. Малорастворим в низших алкае!олах и нерастворим в ацетонитриле.

Зто вещество амфотерное и имеет титруемые групгпы рК „, = 4,0; рК,, = 5,3; pI(„„= 9,2; рК „, = 10,5. Мол.,вес 526. Хи,мичес хий состав, вес. %: углерод 41,01; водорол 5,64, азот 15,75, кислород 29,28, сера 7,04. Удельное вращение (а) Р + 86,2 (С = 1% .вес, объем в воле).

Смесь его с минеральным гмаслам имеет следующие хара ктерпые полосы поглощения в инфрахра."ной ооласти спехтра: 3,15; 5,70;

6,30; 7,22; 7,64; 9,05; 9,40; 9,65; 11,60 лк.и.

Содержание фактора 1 в àíI)HoHQTIH!Ke 16886 составляет 1 — 99%, а фактора II — 99 — 1%.

Примеси составляют 1%, поэтому они не были идентифицированы.

511027

15

При проведении качественно.-о анализа смеси моноаммиачной соли фактора I и 11дали положительные результаты с нингидрином, .по

Пан-Дутшеру, Бенедикту, Молиту, Фелингу, с дансилхлоридом, йодом, хлоридом железа.

Отрицательные результаты были:получены с биуретом и реагентом Сакагуши. Смесь моноаммиачных солей факторов 1 и II, высушенных прои,комнатной температуре в вакууме над безводным хлоридом кальция в течение

15 ч, обладала способностью вращать плоскость поляризации (а) 2в + 110,1 (С = 1%

Bec/объем в воде). Смесь моноаммиачных солей факторов I u II стабильча при рН 3 — 8 и температуре 6 С в течение 8 дней. Относительно стабильна при рН 3 — 8, температуре

25 С в течение 2 дней. Биологическая активность смеси медленно терялась при рН 3 — 8 и температуре 25 С. Наполовину активность уменьшалась через 4 дня.

Элеме нтарпый анализ моноамииачных солей А 168861, высушенных в ва кууме над,пятиокнсью фосфора.:при температуре 80 С по:казал, что эта соль содержит 5,02% метокси:! а. Присутствие,метоксильной группы подтвердилось синглетом .прои 3,53 мг/л спектра ядерно-магнитного резонанса. При о пределении методом Ван-Слойка установили, что моноаммиачпая соль фа ктора I содержит 5,3% азота амина. По спектру ядерно-магнитного резонанса для фактора I в DqO установил и следующие характеристики: 5,19 мг/л (1Н, синглет); 4,94, 4,74 мгlл (2Н, АВ квартет, I = 13 Ги); 4,0- —:4,2 мг/л (1Н, мультиплет);

3,68, 3,32 мг/л (2Н, АВ квартет, 1 = 18 Гц);

3,53 мг/л. (ЗН, синглет); 2,6 — 2,4 мг/л (2Н, мультиплет); 2,1 — 1,6 мгlл (4Н, мультиплет).

На спектре поглощения в ультрафиолетовой области антибиотика А 168861 в водном растворе видны максимумы поглощения при

242 лхкм (E „";, = 132) .и п ри 264 люклс (Е „" ;, = 165); измеряли также круговой дихроизм в водном растворе .и установлен .положительный эффект Коттона при 263 лкм и отрицательный эффект Коттона при 236 мкм.

При хроматографиями на бумаге аммиачной солтан антибиотнка А 168861 (с,применением бумаги Ватман № 1) получили значение

Яу = 0,41 в системе растворителя пропанол— ацетонитрил — вода при объемном отношении

1:1:1.

Биоавтографы был и .получены при помещении хроматограммы,на агаровые пластиночки, на которые был посеян Salmonella gallinarum в качестве испытуемого микроорганизма.

При хроматографии в тонком слое антибиотика на силикагелевых пластинках в

70%-ном водном ацетонитриле с опрыскивачием нингидр ином в качестве индикатора, R; =- 0,51; на целлюлоз ных стеме ацетонитрилизопропанол — вода К -= 0,36.

Аминокислотный анализ антиоиотика

А 168861, проведенный по методу Спакмана—

Мура и Штейна, показал два пика, соответст20

60 вующ ие реа

При электрометрическом титровании моноа ммиач ной сол и антибиотика А 168861.1 в

66% ном,водном растворе дчгметилформамида лри значении рН 7,7 установили присутствие четырех титруемых групп: рК,„, = 4,4; pI(.,=

= 5,7; pK,ç = 9,6 и рК,„, = 10,4.

При значении рН равном 6,8 получили соответстзующие значения рК „= 4,0; pK,„, = 5,3; рК „= 9,2; рК ... = 10,5.

Анализ фактора 11,в системе ядерно-магнитного резонанса по казал отсутствие сигналов, характерных метаксильпых групп в гротивоположность фактору I.

Спектр ядерного мапнит но-резонанса

А 1688611 в DqO дал следующие хара ктеристики: 5,75 мг/л (1Н, дублет, !=5 Ги); 5,15мг/л (1Н, дублет, = 5Ги,); 4,90 — 4,68 л1г/л (2Н, АВ квартет, I = 13 Гц); 3,9 — 3,7 лг/л (1Н, мультиплет); 3,69 — 3,39 л г/л (2Н, АВ квартет, = 18 Гц); 2,6 — 2,3 (2Н, мультиплет);

2,1 — 1,5 (4Н, мультиплет).

При анализе методом Вап-Слайка у=тановили, что в антибиотике А 168861! =oдержнтся 5,1% азота.

Ультрафиолетовый;спектр .поглощения антиоиотика А 1688611 в,водном растворе локазал максимум потлоще|ния при 260 лил (Е,"," „= 148) . При измерении,кругово, о тихроизма в водном растворе установили положительный эффект Коттона при 258 лкм и отрицательный эффект при 228 л км.

В результате хроматографии ra бумаге (ватман № 1) фактора II .получили значение

Я/ = 0,33 в системе растворителя пропапол— ацетонитрил — вода, при объемном отношении 1: 1: 1. Биоавтографы получили при помещении бумажной хроматографии,на агаровые пластинки, засеянные Salmonella gallinarum в качестве испытуемого организма.

При хроматографии в тонком, слое моноаммиачной соли антибиотика па сили кагелевых пластинках в 70%-нам водном ацетонитриле с опрыскиванием ппнгидрипом получили значе-!

må Я/ = 0,42; на целлюлозных пласт инках в системе ацетонитрил: изопропанол: вода =

=1:1:1, Ку=0,29.

Аминокислотный анализ кислого гидролизата антибиотика методом Спакмана — Мура — Штейна обнаружили в начале только один пик, соответствующий реакции нипгидргггга, его элюировали непосред=твенно перед пр ..мен.нием глицина и идентифицировали как п-аминоадипиновую кислоту (2,1 ммоль/ лг). Однако имелись также другие маленькие пики, которые элюировали глицином. Следующий образец анализировали таки м же методом и установили величину 2,1 ялюоль/мг и

0,13 ммоль/лг соответственно.

511027

Этанол — вода (80: 20) и

1,5% хлорида натрия; бумага, пропитанная 1 н. раствором сульфата натPII II.

10,00

1,00

0,38

0,33

Бутанол, насыщенный водой

Неподвиж,ный

Неподвиж-!

Н6Ш

2,00

1,00

Бутанол, насыщенный водой и 2% п-толуолсульф о 1< I I с.1 0 т ы

20.00

10.00

0,39

0,32

Метилизобутилкетон, насыщенный водой Неподвиж1ный

1 НеподвижI H ЬIЙ

Неподвижный

Метилизобутилкетон, насыщенный водой и 2% и-тол) олс) льфо1<ислоты

Неподвиж ный

Метилизобутплкетон, насыщенный водой и 2% пиперидина.,1-1 подвиж ный, НеподвижИ1Ь1й

1 Неподвиж. ный

15, Неподвижный

1

11еподвиж ныЙ

Лцстонитрил

Пропапол — ацетонитрил— метанол — вода (4:3:2:1) Неподвижныйй

5 л 1

Г!ропанол — пиридин — уксусная кислота — вода (15: 10; 3: 12) 0,27 35

0,32

Пропанол — пиридин — уксусная кислота †ацетонитрил †во (45: 30: 9: 40: 36) 0,15

0,21

Бутанол — уксусная кислота — вода (3: 1: 1) 0,20

0,17

3

Соевая мука

Казеин

Нитрат натрия

Гликозный сироп (50% глюкозы)

Водопроводная вода, л

Этплацетат — уксус11ая кислота (3: 1: 1) 0,29

0,17

0,22

Пропанол — вода (70: 30)

Лцетонитрил †во (70: 30) О,!7

:0,72

0,65

Вода — эта нол — уксусная кислота (70: 42: 6) 0,82

0,82

Хроматография в тонком слое

Лцетонитрил — вода (7: 3) на целлголозных пластинках

0,35

0,29

5,0

Исследования моноаммиачной соли антибиот ика гметодами хро матографии на бумаге и хроматографии в тонком слое в разных системах растворителя дали следующие результаты.

Система растворителя Значения R, ХРоматогРафии на бУмаге фактор 1 ) фа«топ ((Антибиотик и его соли задерживают рост кап< грамположительных, так и грамотрицательных ба1ктерий.

Прекращение роста микроорганизмов лри минимальной концентрации наблюдалось в течение примерно 24 ч.

Антибиотик и его соли пригодны для борьбы с:инфе1«цией. О ни обладают активностью в отношении оа-.<терий,,патогенных для растепНА.

Пример 1. Приготовление антибиотика во встряхиваемых склянках.

Культуру Streptomyces clavuligI rus 3585 в форме спор выращивают на твердом косом агаре, имеющем следующий состав, г:

Декстрин

Дрожжевый экстракт

Ггпдролизованный,казеин («H — Z» типа ами,на «А» фирмы Шеффилд Кэмикал Компани)

Мясной экстракт

Агар Меера (промытый трижды)

Де.. .c:.nçnðîâàníàÿ вода

Добавлением гидроспвиси натрия устанавливают рН среды 7,0. Выращивание осуществляют в течение 4 — 6 дней при 30 С. 1 мл выращенной культуры вводят в виде водной суспечзии в 100 мл вегетативной среды при рН 6,7 следующего состава, г:

Глюкоза

Соевая лука

Твердые вещества вымоченной н<укурузы

Карбонат кальция

Хлорид натрия

Деионизированная вода, Вегетативный посевной материал встряхивают в течение 24 — 28 ч при 30 С, при одновременном вращении аппарата со скоростью

40 108 об лпн. На 100 мл приготовленной среды состава, г:

50 предварительно стерилизовапн прн 120 С в течение 30 мин, помещепной в,колбе Эрленмейера емкостью 500 мл, высевают полученный 5%-ный вегетатпвпый посевной материал, после чего «олбу,встряхивают в течение

55 48 — 72 ч при одновременном вращениями аппарата со скоростью 250 об(мин. Во время брожения среду аэрируют стерильным воздухом при его расходе 0,4 об (мин.

Пример 2. АнтиЬиотик получают чо примеру 1, используя среды следующего состава, гг

Растворимые вещества отходов винокуренного завода

65 (Нардисел) 511027

П р,и м ер 3. Антибиопик получают, каK в примере 1, но используют следующую питательную среду, г: хлопчатника 20,0

10.,0

5,0 вода, л 1,0

Мука из семян

Глицерин

Глюкоза

Водопроводная

Пример 4. Приготовление антибиотика на среде следующего состава, г:

20,0

10,0

30,0

4,0

5,0

5,0

2,0

1100

П р и,м е р 5. Приготовление антибиотика на среде следующего, состава, г:

П р и м ер 6. На косой агар следующего состава, г:

10,0

1,,0

2,0

1,0

0,01

20,0

1 при рН 7,0 установленного с помощью гидроо)киси натрия, засевают культуру Streptomyces cIangIigerus 3585 и выдерживают прн

30 С в течение 7 — 10 дней. Выращенную таклм образом культуру помещают в 2,0 мл стерильной бычьей сыворотки. Затем 1 мл полученной суспензия переносят в лиофиловую трубку и высушивают,при н изкой температуре до образова ния таблеток. Полученные таблетСоевая мука (Нутр|исой 200 Д)

Арахисовая мука

Меласса с патокой

Овсяная мука

Глицер|ин

Водопроводная вода, Ггнокоза

Растворимый .крахмал

Пелтон Вильсона 159

Г ндролизованный казеян («Н — Z» типа амина «А» фирмы Шеффилд Кэмикал

Компа н и)

Шестиводный сульфат магния

Меласса с патокой

Карбонат натрия

Водопроводная вода, мл

Гли церлин

Соевый пептон нитрат,кальция

Хлорцд натрия

Надрисол

Водопроводная вода, Декстрин

Дрожжевой экстракт

Гидролизованный казеин («Н — Z» типа амина «А», Шеффилд Кэмикал

К.омпан и)

Мясной экстракт

Шестиводный хлорид,кальция

Агар Меера

Деиониэироваяная вода, л

5,0

5,0

5,0

5,0

10,0

1,0

20,0

5,0

2,0

0,5

3,0

1 ки помещают на питательну|о среду следующего состава, г:

10,0

20,0

15,0

5,0

5,0

0,2

Глицерин

Сахароза

Зерна сои

Янтарь BYF 300

Триптон

Диофосфат калия

Водопроводная вода, 10.2 при рН среды, установлечной гидроокисью натрия.

15 Пример 7. Приготовление антибиотика на опытной установке.

В бродильный чан из нержавеющей стали емкостью 40 л,загруз ил и 24 л среды следующего состава, г:

Антифом А (присадка,,препятствующая вспениванию, фирмы Дау Корвинг Компани)

Крахмал

На,дрисол

Мука

Глицерин

Амин А

Шестиводный сульфат железа

Холодная водопроводная вода, л

5,0

1125,0

125,0

500,0

187,0

125,0

2,0

30

До 24

Пер;зопачальное рН 5,9 доводят до 6,5 добавле нием 20 мл 5 н. раствора гидроокиси натрия при 120 С m давлен|ии 1,05 — 1,26 нг/см в течение 30 мин. На приготовленную таким образом среду высевают культуру, полученную по,примеру 6. Процесс брожения проте40 кает прои 30 С в течение 66 ч при аэрации стерильным воздухом, подаваемым со скоростью

0,35 объем/объем/мин и перемешивании механической мешалкой со скоростью вращения

420 об/мин. Конечное зна чен|ие рН 6,3.

45 Пример 8. Примерно 75 л бульона, iHoлученного,по при меру 7, профильтравывают через Гифле Супер — Цел (диатомовая земля, выпускаемая в продажу фирмой Джонс — Манвилл Продактс), в количестве 5 г/100 мл.

50 Фильтрат .пропускают через колонну размером 9,5Q 130 см, наполненную 8 л угля (Питтсбург 12 Х 40), со скоростью 60 мл!мин. .Колонну промывают 10 л деионизированной воды (рН 5,2) и 50%-ным,водны м ацето55 ном. Полученные отдельные фра кции объединяют и в вакууме отгоняют ацетон. Затем снова пропускают через колонну, на полненную дауэ ксом 1 — XI. Колонну промывают

10 л деион изированной воды и 0,1 М раствором мура вьинокислого аммония. Фракции объединяют и пропускают через колонну

9,5 х 100 см, наполненную углем, со скоростью 60 мл/мин. Колонну промывают водой и элю ируют омесью ацетона я воды в отношении 1: 4 со скоростью 60 мл/мин.

511027

13 общей

1111 2

1 lf в

8 нс — (с,е,),— c — m

1 ооон 0 Я -- Ы2 0-С ЫН2т

Все фракции объединяют, концентрируют в вакууме, отгоняют ацетон и лиофилизир уют.

Затем 40 г лиофилизированных препаратов экстрагируют 4 л метанола при механическом перемешиван>ии в течение 16 ч; нераствор имые в метаноле вещества отфильтровывают, а растворимую часть осаждают 5 объемами ацетона. Осадок отфильтровывают и высушивают. Выход 20,6 г.

Этот препарат растворяют в мивимальном количестве воды и пропускают через колонну размером 5,l8 х 120 л л, иаполнеппую декстраном (Сефадекс С-25), со скоростью

1 л л мин. Затем элюируют деионизирозанной

>водой, фракции объединяют и лиофилизируют.

Полученный продукт в количестве 10 г растворяют в 256 мл смеси ацетона с водой (55:45) и пропускают через колонну раз>мером 5,5 X 8,5 см, наполненную силикагелем, пр иготовленныам в смеси ацетона,с водой (7: 3). Раствор пропускают через колонну со скоростью 3 мл)мин. Колонну элюируют смесью ацетон — вода (7: 3) со скоростью

5 мл мин, Фракции>и объединяют, упаривают в ва,кууме досуха и лиоф илизируют.

Полученный .продукт — смесь,моноаммонийных солей фактора 1 и фа>ктора II, и может быть использован для борьбы с глистами.

П р и м ер 9. Выделен1ие факторов 1 и 11 антиб иотика iB форме моноаммонийной соли.

Полученный препарат, описанный в примере 8, в количестве 10 г растворяют в 197 мл смеси ацетон — вода (55:45) и пропускают через, колонну размером 4,0 х 130 см, содержащую 1,6 л микро>кристаллической целлюлозы (Авицел) в смеси ацетонитрил — вода (7: 3). За ходом элюирования следят методом хроматографии на бумаге. В результате элюирования получают множество фракций, каждая >из,которых содержит првимущественно один фактор. Фракции с соответствующими факторами объединяют и лиофилизируют.

>Пример 10. Приготовление хлористоводородной соли антиб иоти ка.

Моноаммопийную соль антибиотика

А 16886, полученную и,выделенную, как опигде R = Н или ОСНЗ, отличающийся тем, что культуру Streptomyces с1ас uligerus ХКК1 3585 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением, целевого про5

45 сано B предыдущих примерах, IB количестве

200 яг растворяют в 2 мл воды. Первоначальное значение рН 5,3 раствора доводят до 2,0 при .дооавлении 1 н. соляной кислоты, а затем раствор упаризают досуха при пониженном давлении. После добавления 5 юг воды и 1,5 л л метанола хлористо>водород ую соль о" аждают добавлением 10 объемоз ацетона.

Осажденный хлоргидрат антибиотика А 16886 отфильтровывают, .промывают и высушивают.

Анализом установлено, что оп содержит

4,50% xlopa. При электрометрическом титровании продукта в 66%-ном растворе диметилформамида в .воде при начальном значении рН 5,0 установили присутствие трех титруемых групп; рК =3>6; рК а =5,2; рК а,= 10>8.

Пример 11. Приготовление динатриезой соли ант>ибиотика.

Моноам монийную соль антибиотика

А 16886 з количестве 200 мг,,полученную и выделенную, как описано в предыдущих примерах, растворяют,в 2 мл воды. Первоначальное значение рН 5,3 доводят до 10,5 добавлением 2,5 1. раствора гидроокиси натрия. Раствор упаривают в вакууме почти досуха. Затем дооавляют 1,5 мл метанола, соль осаждают 10 объемами ацетона. Динатриевло соль антиоиотика выделяют путем фильтрования> .промывают ацетоном и высушивают.

Анализ показал наличие 6,73% натрия.

Пример 12. Приготовление антибиотика в форме кислоты.

Смесь моноаммопийной соли антибиотика

А 168861 и А 1688611 в количестве 20 л г растворяют в 40 мл воды. К раствору добавляют

6 мл смолы Дауэкс 50 — Х12 (Н+), перемешивают в течение 30 лшн и профильтровывают через воронку из среднеспекшегося стекла. Фильтрат (рН 2,65) лиофилизируют.

При электрометрическом титроваиии в

66%-ном растворе диметилформампда в воде, при лервоначальном значении рН 4,3, установили налпчиетрехтитруемых групп: рК,,=4,2; рК а,, =5,6, рК à.

Формула изобретения

1. Способ получения антибиотика формулы дукта в виде основания или соли известными приемами.

2. Споcîá по и. 1, о т л и ч а ю щ,и и с я тем, что выращивание осуществляют при 25 — 37 С в течение 36 — 72 ч.