Способ получения нерастворимого фермента

Способ получения нерастворимого фермента

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

(1Ц 5l27I9

Со1ов Советски

Социалистических

Республик

К и АГЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (51 ) Ч Кл - С 12 D 13/10 (22) Заявлено 31.08.72 (21) 1825022, 28-13 (23) Приоритет — (33) 01.09.71 (31) 40859 (33) Великобритания

Государственный комитет

Совета Министров СССР ло делам изобретений н открытий (53) УД1(576 15.08 (088.8) Опубликовано 30.04.76. Бюллетень ¹ 16

Дата опубликования описания 06.08.76 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Сидней Алан Баркер и Джон Фредерик Кснеди (В с л 11 к о о р 11т а 11 и я ) 1 1 и о с Т 2 и н а 51 ((111 p i I

<:АСТРО Николас Лимитед» (Вслпкобрптанпя) (71) Заявитсль (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕРАСТВОРИМОГО ФЕРМЕНТА

Изобретение относится к области получения нерастворимых ферментов и может найти применение в медицинской, микробиологической и пищевой промышленности.

Известен способ получения нерастворимого фермента путем смешивания его с водной суспензией носителя с последующим отделением твердой фазы. Однако он многостадиен и сложен.

Предложенный способ позволяет упростить процесс получения нерастворимого фермента.

Для этого в качестве носителя используют полимер, содержащий повторяющиеся пары смежных гидроксильных и карбоксильных групп.

Таким полимером служит полимер ортогидроксибензойной кислоты, имеющей в качестве заместителя ароматического кольца ненасыщенный радикал формулы — Х вЂ” (CO) — CR= CRIRg, где R, RI и R> — независимо водород, алкил, содержащий от 1 до 6 атомов углерода, или галоген; п=1 или 0;

Х вЂ” кислород, сера, иминогруппа или метилен. В качестве полимеров ортогидроксибензойной кислоты используют, например, гомополимеры М-акрилопл-4-ампносалициловой (поли-4-кислота) и Х-акрилонл-5-аминосалициловой (полп-5-кислота) кислот и комплексы этих гомополимеров с солями бора и титача.

Нерастворимые ферменты получают простым смешиванием фермента с водной суспензией полимеров с последующим отделением твердой фазы.

П(эимеразlп комплексов фермент/полимер, имеющих удовлетворительные свойства, по данному изобретению могут служить: (3-глюкозидаза/титановыи комплекс гомополимера Х-акрплоил-4-аминосалицпловой кислоты;

Р-глюкозидаза/тптановый комплекс гомополимера N-акрплопл-5-аминосалициловой кислоты; лактатдегидрогеназа/боратный комплекс го20 мополимера Х-акрилоил-4-ампносалициловой кислоты: лактатдегидрогеназа/гомополимер N-акрил0Н;1-4-аминосалициловой кислоты; (з-глюкозидаза/гомополимер N - акрилоил-425 ахпгносалициловой кислоты; р-глюкозидаза/гомополпмер N-акрилоил-5аминосалпциловой кислоты; лактатдегидрогеназа/боратный комплекс ro3

512719

MoIIo7IsvIep2 Г -2KpHJIOHë-5-ам11носалици70вой

КИСЛОТЫ; лактатдегидрогеназа/гомополимер iN-якрилоил-5-амипосалициловой кислоты; а-амилаза/титановый комплекс гомополимера N-акрилоил-4-ЯминосалицилОВОЙ кислОты; а-амилаза/титановый комплекс гомополимера N-акрилоил-5-аминосалициловой кислоты; глюкамилаза/титановый комплекс гомополимера N-акрилоил-4-амипосалициловой кис- 10 лоты; глюкамилаза/титановый комплекс гомополимера Ni-акрилоил-5-аминосалициловой кислоты.

В процессе использования полимерно-фер- 15

iv!pI!TIIbIp ком 1лексные соединения загружают в колонну, заполненну10 твердым инертным носителем, нап11имср стекля111!ыми Оусипами.

Пример 1. Взаимодействие комплексной боратной и некомпле сной поли-4-кислоты с 20 л акт атдегидро ген азой.

Водный раствор лактатдегидроге! азы добавляют к суспензии поли-4-кислоты или ее боратному комплексному производному, немедленно центрифугируют и выделяют твердофаз- 25 !

ые комплексы: поли-4-кислота/лактатдегидрогеназа и боратная комплексная поли-4-кислота/лактатдегидрогеназа.

Получение Ж-акрилоил-4-аминосалициловой кислоты

400 г аминосалицилата натрия и 00 г двууглекислого натрия растворяют в 250 мг дистиллированной воды и размешивают в течение 35

1 час. Затем к раствору дважды добавляют хл013ИСТЫЙ ai pHJioH s! (20 ivi.i Ii 10 ivIJI), llepevieшивая смесь после каждой добавки 1 час рН смеси доводят до 4 — 5 10 н. соляной кислотой.

Затем civIPcb фильтруlот и Осадок промывают 40

500 мл дистиллированной воды.

N-Акрилоил-4-аминосалициловую кислоту перекристаллизоBûBают из вод! ого эT2110ëа, выход 27 г, т. пл. 227 — 229 С.

Вычислено, %: С 58,0, Н 4,35; iN 6,76. 45

Найдено, %: С 57,7; Н 4,35; N 6,65.

Получение полимера iN-акрилоил4-аминосалициловой кислоты

150 ivlivl акрилоил- ":-аминосалици 20В011 кис- 50 лоты и 9,36 г буры растворяют в 180 мл дистиллированной воды и доводят рН раствора до 9,0 10 н. едким натром. В полученный раствор добавляют 150 мг азобпсизобутиронитрила, растворенного в 50 мл этанола, и нагре- 55 вают 48 час при 80 С с обратным холодильником. Полученный вязкий раствор разбавляют

200 мл дистиллированной воды. При подкислениипоследнего до рН 2 5 и. соляной к11слотой образуются тяжелые белые хлопья полиvicp2. Осадок 10 раз промывают дистиллироВа;шой Водой, которую всякий раз берут в

11-кратHO» избытке по отношению к объему осадка. Следы борной кислоты удаляют при

s, 112PiiB2iiHi В РОтаЦИОННОМ ИСПаРИтЕЛЕ РаСтВОра ПО iHviepa В метаноле. Полимер хранят В

Виде суспензии в 200 мл дистиллированной воды. Для определения содержания воды в no7HvIepe последний отфильтровывают и высушивают над пятиокисью фосфора в вакууме при 60 С. После сушки получают твердое, хрупкое, коричневое, прозрачное вещество. Отфильтрованный полимер содержит 93 вес. воды.

Получение боратного комплекса поли-4-кислоты

Боратный комплекс полимера получают суспендированием 000 мг отфильтрованнОГО полимера в 1 мл водного раствора буры; рН смеси доводят до 7,0. Образующийся комплекс отделяют центрифугированием.

Боратный комплекс получают также и другим способом. Для этого 5 r вязкого раствора, lio. 1v eHHoão после полимеризации поли-4-кис,!Оты, разбавляют 70 мл дистиллированной воды и полученный раствор подвергают диализу в течение 48 час с 10 ооъемами (по 5 л каждый) против 0,005 M боратного буферного раствора с рН 7,0.

Удаление лактатдегидрогеíàзы из комплекса поли-4-кислота/лактатдегидрогеназа

Образец комплексного соединения поли-4кислота/лактатдегидрогеназа, приготовленный вышеуказанным способом, центрифугируют и отделя10т твердофазный фермент.

11рочность связи фермента с носителем определяют многократно, промывая комплекс

110ли-4-кислота1лакт2тдеГидрогеназа дистиллированной водой и измеряя активность фермента 13 промывных водах. Лктивность опреде,,ti1iI0T liO 113iV1eHeHHiO ОПТИЧЕСКОЙ IioIOTHOCTH IIPH

340 м 0,4 М растворов пирувата натрия объеv10vi в 1 мл, в которые добавляют пробы промывных вод и надосадочной жидкости объеviovi в 0,5 мл.

В заключение комплекс поли-4-кислота/лактатдег;1дрогеназа промывают 1 мл раствора молочной кислоты, в котором также измеряют акт!HiliocTb Вышеу казанным спосооом. Параллельно г роводят контрольные опыты с использованием 0,4 М раствора пирувата натрия (опыт А), а также раствора пирувата натрия

В 1 М мо70«IIOI; кислоте (опыт Б).

К0 1цеllт13ация лактатдегидрогеназы в контроль:ых опытах — 0,4 ммоль в 1 мл. Полу,0111iь1е результаты представлены в табл, 1.

512719

Таблица 1

Оптическая плотность

Разность

Среда определения активности фермента начальная конечная (0,630

0,910

0,940

0,960

О, 610

0,290

0,200

0,140

1,240

1.200

Надосадочный слой после центрифугирования

То же+промывная вода после первой промывки

То же+промывная вода после второй промывки

То же+промывная вода после третьей промывки

1, 140

1,100

0,885

0,215

1,100

То же —, промывной раствор после промывки молочной кислотой

1,042

0,162

1,204

Контрольный опыт А

Контрольный опыт Б

0,034

0,135

1,170

А. Пали-5-кислоту (5 г) дпспергируют в дистиллировягп ой воле измельчителем лля тка.3и; рй проб дl сперг. равяпного полимера (1,0 м,") ус-анявл;1вают с помощью 5 и. соля. ой кислоть. II.7. . ел: ого натса. В кажлу10 пробу добавляю-. лактатдегплсогеназу (10 мл) и выдерживают перел центрпфугированием в течеп:1с пол,"-,ася. Осадок лважлы промывают лнс-.::л,711ровя.1най водой (1 мл) и после кажлой громывкп це:1трифугпруют В заключение

130ли:ii, 3 л13ажлы прамь!Вя1ст 1 41 молочной кисло-.oi (1,0 мл) и 11е: трпфуi llpyi07. В каждом пяласалочном слое после цепт1зифугирова.и я оп сд"л.".ют активность лактатдегидрогеня.".ы при 340 нм. Результаты приведены в

Тяа.1. 2.

Вышеуказанные результаты свидетельствуют о том, что поли-4-кислота и ооратнокомплексная поли-4-кислота взаимодействуют с лактатлегилрогеназой и :-.0 л а ктатдегидрогеназу можно удалить чз а.и: комплексных сое- 5 дине: ий путем промывки конце,l.ilèðîâã.ííûì суостратсм фермента, ".априм р молочной кислотой.

Необходимо отметить, -Зто г ляIIIIo случае комплекс фермент/полимер не имеет фермен- 10 тативной активности, хотя и является исто iHHком актигного фермента.

П р и.;1 е р 2. Взаимодействие некомплексной поли-4-кислоты и поли-5-кислоты с лактат- 15 дегидрогеназой и глюкамилазой.

Таблица 2

Разность в оптическoii плотности после

Оптическая плотность первого надосадочного слоя рН

2-ой

1-ой промывки промывки молочной кислотой промывки ! раствора

0,91

0,66

0,30

0,16

0,11

0,25

0,20

0,13

0,00

Вышеуказанные результаты показывают, что поли-5-кислота образует комплексные соединения по мере увеличения рН от 2 до 9 с увеличивающимся содержанием лактатдегидрогеназы.

Б. Пробу (2,0 мл) суспенлировянпого полимера центрифугируют и осадок дважды промывают уксуснокислы: буферным раствором (рН 4,5). В полимер добавляют водный раст 30 > l л1скаа1и 72351 (1,0 хlл, 18,5 мг/мл) 13 JIBKтятдегндрогеназе (10 мл), полученную смесь центрифугируют. Осадок дважды промывают водой (1,0 мл) и 1 М молочной кислотой, после каждой промывки проводят центрифугирование. Д.чя каждого надосалочного слоя после центрифугирования опрелеляют активность лактатдегидрогс::язы и глюкамилазы, 25 Полученные результаты приведены в табл. 3.

3

5 б

8

0,93

0,73

0,54

0,45

0,20

0,00

0,07

0,07

1,06

0,05

0,26

0,34

0,14

0,29

0,26

1,08

1,15

1,25 !,49

1,15

1,53

1,36

1,45

512719

Таблица 3

Разность оптических плотностей для

Среда определения активности фермента ла ктатдегидрогеназы (134 пм) глюк амилазы (460 нм) Первгяй надосадочный cëîé

То же — промывная вода после первой llpoмывки

0,609

0,235

0,09

0,37

То жег-промывная вода после второй промывки

То же i-промывной раствор после промывки

1 М молочной кислотой

0,039

0,060

0,04

1,67

Из данных табл. 3 видно, что образование комплексных соединений фермент/полимер протекает с лактатдегидрогеназой лучше, чем с глюкамилазой, открывая тем самым путь для разделения этих ферментов, В. Опыт проводят по методике примера 2Л. яо с использованием поли-4-кислоты, ПолученJib!r . результаты приведены в табл. 4.

Таблица 4

Разность оптических плотностей после

Оптическая плотность первого надосадочного слоя

РН промывки

BIO IO rH0É кислотой первой промывки второй промывки раствора

0,52

0,43

0,40

0,24

0,00

0,11

71:

" При РН 7 поли-4-кистота проявляет тепденцгпо к гелеобразованию. Стандарт 0,92.

Вышеуказанные результаты показывают, что поли-4-кислота по мере увеличения рН (с 2,0 до 7,0) интенсивнее образует комплексные соединения с лактатдегидрогепазой.

Г. Методика опыта аналогична примеру 2 В с .использование.; поли-4-кислоты.

Полученные результаты приведены в табл. 5.

Таблица 5

Разность оптической плотности лактат:råгидрогевазы при

340 нм

Активность" глюкамилазы мг/1 моль

Среда определения активности фермента

Первый надосадочный слой

То же+промывная вода после первой промывки

То же+промывная вода после второй промывки

То же-;-промывной раствор после промывки

1 М молочной кислотой

15,0

5,0

Вес глюкозы, выделяемой стандартным раствором крахмала.

Результаты табл. 5 показывают, что комплексные соединения поли-4-кислоты образуются предпочтительно с лактатдегидрогеназой, и не с глюкамилазой, Это указывает на возможный путь разделения этих ферментов.

Д. Опыт проводят по методике примера 2 В с использованием одной глюкамилазы (1 мл, 18,6 мг) с промывкой уксуснокислым оуферным раствором (2 мл, рН 4 — 5).

Полученные результаты приведены в табл. 6.

3

0,80

0,79

0,42

0,10

0,20

0,07

0,46

0,40

0,26

0,00

0,10

0,00

0,32

0,20

0,10

0,85

0,68

0,80

0,80

0,90

0,92

0,92

512719

Т а блица 6

Активность глюкамилазы, мг, 1 моль

Среда определения активности фермента

Первый надосадочный слой

То же+промывной раствор после первой промывки ацетатным буфером

То же-, -промывной раствор после второй промывки ацетатным буфером

Стандарт

" Бес глюкозы, выделяемой стандартным раствором крахмала.

Таблица 7

Разность опти IecKI!x плотностей при 420 нм для надосадочного слоя после соединения фермента с полимером (25 мл) исходного раствора фермента (25 мл) Образец твердофазного фермента

2,000

Больше 2,000

2,000

Больше 2,000

1,950

1,300

0,052

0,048

0,034

0,064

0,050

0,062

0,800

0,800

0,800

0,800

0,800

0,800

4Б

4В

5А

5Б

5В

0,042

0,014

0,013

Некаталитическая реакция

Данные табл. б свидетельствуют о том, что поли-5-кислота не образует комплексных соединений с глюкамилазой (см. приведенный ниже пример) .

Получение поли-5-кислоты

Применявшуюся в вышеприведенных примерах поли-5-кислоту готовят по способу, приведенному в примере для поли-4-кислоты. Отличие состоит в том, что в данном случае используют 5-аминосалицнловую кислоту (40 г), а не 4-аминосалицилат натрия, Выход N-акрилоил-5-аминосалициловой кислоты 25,8 г, т. пл. 218 — 219 С.

Вычислено, Я . С 58,0; Н 4,35; N б,75.

Найдено, %: С 57,5, Н 4,5, М 5,5.

Конечный продукт имеет розовую окраску.

Боратнокомплексная поли-5-кислота может быть получена по методу, описанному в примере 1. Исходным материалом служит 5-аминосалициловая кислота или поли-5-кислота.

Пример 3. Взаимодействие титаноко vIплексной и некомплексной поли-4-кислоты и поли-5-кислоты с глюкозидазой. р-Глюкозидазу вводят во взаимодействие со следующими образцами:

4A — комплексное соединение поли-4-кислоты с высушенным титаном;

4Б — комплексное соединение поли-4-кислоты с обезвоженным титаном;

4B — некомплексная поли-4-кислота;

5А — комплексное соединение поли-5-кислоты с высушенным титаном;

5Б — комплексное соединение пали-5-кислоты с обезвоженным титаном;

5 — некомплексная поли-5-кислота.

Каждый образец (20 мг) промывают пять раз (по 5 мнн) дистиллированной водой. В каждый образец добавляют р-глюкозидазу (1 MI) в дистиллированной воде (5 мл). Смесь размешивают 1б час при температуре около

4 С. Зятем смеси цснтрифугируют. Из исходного раствора фермента и из каждого надосадочного слоя, после соединения фермента с полимером, берут пробы (25 мл). В этих пробах определяют активность фермента с целью определения про ности связи Р-глюкозпдазы с полимером. Образцы пять раз промывают (каждая промывка продолжается 5 мин) ди20 cTIIëëIIðoâà!Iíoé водой и удаляют надосадочный слой. Затем добавляют 2 мл 0,005 М уксуснокпслога буфера (рН 5), и из надосадочнага слоя отбирают пробы для определения активности.

25 Активность р-глюкозндазы в вышеуказанных пробах определяют по скорости образования о-нптрофеннл аннана в растворах î-IIIITpoфе.III;I-P-у глюкопиранозида. Полученные результаты приведены в табл. 7.

512719

Приведенные результаты показывают, что почти вся содержащаяся в исходном растворе

$>-глюкозидаза соединяется с полимером.

Десятикратная промывка (Ilo 5 мин каждая) 0,005 М уксуспокислым буферным раствором, 0,1 М уксуснокислым буферным раствором или 0,5 М раствором хлористого кальция нс приводит к существенному снижению активности твсрдофазн1 1х фсрме: Io13, Однако пять пятиминутных промывок 1 М раствором сахарозы в 1 М растворе хлористого натрия и затем в 0,005 М уксуснокислом буфере снижают активность примерно до 1/3 от наблюдавшегося до промывки уровня.

Использование в примерах 4А, 4Б, 5А и 5Б титанокомплексные полимеры готовят следующим образом.

Полученную, как в примере 1, поли-4-кислоту дважды промывают 5 н. соляной кислотой, потом дважды дистиллированной водой, а затем суспензируют в 12,5 вес./об. /о растворе хлористого титана (10 мл) и размешивают

15 мин. Смесь отфильтровывают для удаления окислительной среды. Остается твердый, окрашенный в оранжевый цвет продукт. Образец делят на две части. Одну часть высушивают в течение ночи в печи при 45 С. Получают образец 4А. Вторую часть оставляют на ночь в эксикатере при температуре 4 С. Получают образец 4Б.

Соответствующее комплексное соединение поли-5-кислоты получают по тому жс методу, но с использованием не белой поли-4-кислоты, а розовой поли-5-кислоты, полученной в примере 2. Оставшийся после фильтрования остаток имеет темно-коричневую окраску. Образец разделяют на 2 части, обрабатывают вышеописанным образом и получают образец 5А (соответствующий 4А) и образец 5Б (соответствующий 4Б) .

Пример 4. Взаимодействие титанокомплексной поли-4-кислоты и поли-5-кислоты с а-амилазой.

Указанные в примере 3 образцы (20 мг)

4А, 4Б, 5А и 5Б промывают пять раз (по

2 мин) дистиллированной водой (5 мл). Последний надосадочный слой отделяют. В каждый образец добавляют раствор а-амилазы из Bacillus subtilis (1 мг в 5 мл дистиллированной воды).

Смесь размешивают 16 час при 4 С. Надосадочный слой удаляют и продукт деггерирования промывают пять раз дистиллированной водой (по 5 мл) и десять раз (по 2 мнн)

0,1 М уксуснокислым буферным раствором с рН 5 (5 мл), Твердофазные ферменты суспендируют в

2 мл 0,005 М уксуснокислого буферного раст5

1О

55 вора с рН 5 и размешивают до получения однородной суспензии. Пробы (по 1 мл для 4А и 5А и по 0,5 мл для 4Б и 5Б) твердофазных ферментов испытывают па активность по конверсии крахмала в мальтозу по методу Бернфельда и др. (Самуэльсон и Страмберг. Carbohydrate Rcsea1ch, 3, 1966, 89). Активность твердофазпых энзимов 4А, 4Б, 5А, 5Б составляет соответственно: 2,56, 2.27, 1.5! и 4,44

СД1МГ

3а единицу активности а-амилазы принимают количество фермента, выделяющееся в

1 311111 при 20 С восстановленный сахар, эквивалентный 1 ммолю мальтозы.

Вьппсприведенныс результаты свидетельствуют о том, что а-амилаза образует комплсксныс соединения с титанокомплексной поли-4-кислотой и поли-5-кислотой и что полученные таким путем твердофазные ферменты облада1от существенной энзимной ферментной активностью.

Пример 5. Взаимодействие титакоком11лексно11 полн-5-кислоты и поли-4-кислоты с глюкомилазой.

Описа11ный 13 примере 4 опыт повторяют, испо1L- опав вместо с.-амилазы 5 мл препарата лг:I.äåêc глюкамилазы (примевно 1 мг/мл).

Пробы (0,5 мл) однородной суспензии твсрдофазного фермента в 2 мл 0,005 М уксуснокислого буфера с рН 4,5 испытывают на активность по конверсии крахмала в глюкoay по мстоду Бернфельда и др. Активность твердофазных ферментов 4А, 4Б, 5А и 5Б со.тавляет соответственно: 0,304,.0,630, 0,323 и 0,450 ед,/мг.

За единицу активности глюкамилазы принимают количество фермента, выделяющееся в 1 мин при 45 С в восстановленнь1й сахар, эквивалентный 1 ммолю глюкозы.

Вышспригеденныс результаты свидетельствуют о том, что глюкамилаза образует комплексные соединения с титанокомплексной поли-4-кислотой и что полученные таким образом твердофазные ферменты отличаются сущсствснной ферментной активностью.

Изменение активности твердофазных ферментов, в зависимости от частоты их использования, определяют путем суспендирования продукта диспсргировапия после опреде7p1(IIH а кти13 ности в О, 1 М уксусc 10KHc. Ioì оуферпом растворе (5 мл, 2 мин), удалспи» надосадочного слоя, суспсндипования продукта диспергирования в 0.005 М уксуснокислом буферном растворе рН 5 (! IJI) и повторного определения активности. Зазем эту опсрацию повторяют еще два ра..а. Результаты измерения снижения активности (в процентах от исходной) приведены в табл, 8, 512719

Таблица 9

Активность фернаента

Начальнав скорость образова11115(ГЛК)КОЗЬI, Л> 2 .1П>Н

Количество фермента, ед л>г поли>вера

Сухой вес, (Il2

Г!ри>иер, ¹

Наг(оса (оч- Твер:IM и ный слой оса;(ок!

0,007 0,031

0,110 о 9

0,110

0,104

0,002

0,002

0,001

0,064

О,!80

0,024

0,130

0,089

0,210

0,086

0,208

О,!ЯО

0,196

5,1

0,002

0,155

0,130

0,002

0,210

0,211

5,5

0,010

О, 175

0,208

6,6

П р и >в е ч à í 11 е. (3 качестве субстрата ферменга во всех нри>верах исиользу>от 520 >вг г.ч >о козы. — -X- — (C0),— CR= CRIRg, (й)стан)ггсл) С. Беллев

Редактор Н. Спиридонова

Тсхред 3. Тараненко

Корректоры: В. Петрова и О. Данишева

Заказ !638 3 Изд. № 141! Тира>к 575 По;(ппснос

ЦI-!ИI IHI I осуларствснного комитета (.овста Ми»петро)3 (:(.(.!7 но делам изоорсгсllllll и открыт ill

113035, Москва, 7,-3 ), атшс);аи наб., д. 4 5

Ти)н)гра(!и)н, lip (.Ellli н<)BB, ют 48 час па водяной бане при 80=(:. Посл разбавления раствора дпстпллпрог>а1 ной 13()дой (20 мл) добавляют 12,5 вес./Об. % ра>ст— вора хлористого титана (20 мл). Прп атом в осадок выпадает 7келто-оранжевое комплексное соединение титана. Гго о" фпльтроПример 11. Описанный в примере !О способ используют для получения комплексного соединения гомополимсра Х-акрнло((л-5аминосалициловой кислоты с использoi>a!«Ie>!

BIviQcTo 4-аминокис;1оты N-акрило11")-5-аминосалициловой кислоты.

Формула изобретс. пя

1. Способ получения нерастворимого фермента путем смешивания его с водной суспензпей носителя с последующим отделение:il твердой фазы, отл и ч а ю щи и с 51 тсм, что 13 качестве носителя используют полимер, содержащий повторяющиеся пары смежны.. гидроксильных и карбоксильных групп.

2. Способ по п. 1, отличающи" ñÿ тем, что в качестве полимера, содержащего по»торяющиеся пары смежных гпдроксильных карбоксильных групп, используют полимер ортогидроксибснзойной кислоты, имеющей» качестве заместителя ароматического кольца ненасьпценпый радикал формулы

>s!>l l3I1I() I 11 11;>О 11»113 10T днсти;1л>111>о>3а нпо1! д(>и 00 ." 1,!!, „ol!n.!»»i. 5! «n (Ос. Б ы ход проду;.i;I 920 мг.

Рс:Зульта.l ы измерения активности твердофаз (ых (1>(;>:;)с1(по>3 приведены в табл. 9. где R, RI .l R> — независимо водород, ал10 кил, содержащий от 1 до б атомов углерода, ил!1 галоген;

n=1 или 0;

Х - — кислород, сера, иминогруппа или мстил си.

I5 3. Снос(>б 1!î II. 2, отличающийся тем, Is(7» качестве по II»cpa ортогидроксибензои-!

loll кислоты, пме(ощей в качестве заместителя ароматического кольца ненасыщенный радикал, используют гомополимсры N-акрилоил-4;(м>пц;салициловой пли il-акрилопл-5-аминосал)п(пл(>вой кислот.

4. Способ по п. !, отличающийся тем, что в качестве полимера, содеракащего повтоp5IIoIIiIlc(.5I пары смежных гидроксильных и

25 карбокспльных Го> пп, испоз>ьзУют комплексы гомополимсров Х-акрилонл-4-ампносалициловой кислоты пли Х-акрилоил-5-аминосалицилои>й кислоты с солями титана или бора.