Способ выделения орготеина

Способ выделения орготеина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Своз Советских

Социалистических

Республик изовеетения

М ПАТЕНТУ (61),(ополнительный к патенту (22) Заявлено30.11.72 (21) 1853251/28-13 (23) Приоритет — (32) 07.12.71 (31) 205609 (33) США (43) Опубликовано05.05.76.Бюллетень Ме 17 (45) Дата опубликования описания 070576 (51) М. Кл.

А 61 К 37/24

Государственный комитет

Совета Министров СССР но делам изобретений и открытий

Иностранцы

Вольфганг Губер, Марк Гари Сайфер (США), Сильвер Хьюнг Чоу (Великобритания), и Анджелика Хедвиг Хьюбнер (ФРГ) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

Дйагностик Дэйт Инк (США) (71) Заявитель (54-) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ОРГОТЕИНА

В качестве исходного материала использу ют кровь.

Рекомендуются животные, ткани которых могут бьггь использованы в качестве источника смесей белков, содержащих ор»готеин и растворимых в буферных растворах, — быки, свиньи, лошади, а иэ птицыцыплята. Наиболее пригодными являются растворимые белки иэ тканей быков, Исходную смесь, содержащую растворимые в буферном растворе и включающие орготеин белки, готовят путем тшательного перемешивания тканей животного с выбранным водным экстрагентом.

Для выделения растворимых белков иэ нерастворимых ткани тшательно измельча» ют, например, в мясорубке, перемешивают с экстрагируюшей жидкостью в быстроходном смесителе.

Эксграгенты и ткани животного берут в объемном соотношении между ними в интервале, примерно 2,3:1 и 2,8:1.

В качестве экстрагента можно испо;:. зовать воду, смесь воды и смешивающегося с ней органического растворителя, наприИзобретение относится к способам про- ) изводства лекарственных препаратов, Известен способ получения орготеина путем хроматографического фракционирования на ионообменных смолах орготеинсодер жашего материала.

11елью настояшего изобретения является повышение выхода целевого продукта, Для этого адсорбцию орготеинсодержа- д шего материала осуществляют на диэтиламиноэтил- или триэтиламиноэтил- целлюлозе при рН 6,0, элюируют буферным раствором с ионной силой не более 0,02М с последуюшей десорбцией целевого продукта l5 градиентным буферным раствором с ионной силой 0,02-0,03М с отделением фракций элюата с оптической плотностью А а или

А<<О, содержаших двухвалентные ионы меди и/или цинка. 20

Для выделения орготеина иэ тканей животных берут печень, Можно брать также почки, сердце, мозг, селезенку, внутренности, мышцы, панцири, шейные железки, лег кие, язык, тимус и поджелудочную железу. 2S (53) УДК 615.361.018.. 51: 61 5. 361. 36 (088.8) 51 ю

3595 мер, ацетона„метанола, этанола, буферный раствор с ионной силой, например 0,01-0,05N, предпочтительно 0,02-0,03M.

Выделение рекомендуют вести при сла бо щелочной величине рН, находящейся в пределах между 7 и 9, предпочтительно между 7,5 и 7,8.

Для повышения ионной силы экстраген-i та в него вводят хлористый калий, хлори-; стый натрий, сульфат двухвалентного мар-, ганца или другие незабуферивающие соли.

Для повышения избирательности буферного раствора в него добавляют растворимые сахариды, например глюкозу, сахарозу и, т.д., что облегчает процесс экстракции.

Смесь суспендированных частиц тКани и водного экстракта разделяют путем фильтрования под давлением или в вакууме, или путем центрифугирования.

Для осуществления способа пригодны растворимые белки красных кровяных клеток, содержащие орготеин и имеющие изо-. электрическую точку, отличающуюся от иэоэлектрической точки ангидразы угольной кислоты, присутствующей в смеси, по меньшей мере, на одну единицу рН. Предпочтительны растворимые белки красных кровяных клеток быков, цыплят и человеKB„

Красные кровяные клетки отделяют от плазмы крови путем центрифугирования, выделенные клетки промывают и повторяют центрифугирование, удаляя остаточную плазму.

Обработанные таким образом клетки подвергают лизису (разрушению клеток) под действием ультразвука, После удаления нерастворимых компонентов клеток, на долю которых приходится около 2 по весу консервированных клеток, раствор растворимых белков из подвергшихся лизису красных кровяных клеток контактируют с хроматографическим адсорбентом, для того чтобы произошла адсорбция орготеина.

Для того чтобы уменьшить влияние растворенных солей на способность орготеина к адсорбированию на хроматографическом адсорбенте, рекомендуют поддерживать ионную силу исходного раствора на уровне от 0,001 до 0,005М.

По предлагаемому способу в качестве адсорбентов используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ), триэтиламиноэтил-целлюлозу (ТЭАЭ), диэтиламиноэтил-сефа-, декс и QAE-сефадекс. Такие смолы име-, ют адсорбционную емкость, составляющую примерно от 1,0 до 5 миллиэквивалента . на грамм.

Орготеин выделяют иэ ионообменмвающей смолы методом избирательного элю-, чрования.

Сначала вымывайт иэ колонки весь гемоглобин и другие не подвергшиеся адсорбции белки, а затем осуществляют избирательное элюирование орготеина из колонки и выделение его из той фракции элюата, которая содержит чистый орготеин.

Удаление гемоглобина, миоглобина и других не адсорбировавшихся белков осуществляют путем промывания колонки водным элюентом, величина рН которого сбставляет примерно 6, или же фосфатным буферным растр вором.

После удаления из колонки гемоглобина и других, не подвергшихся адсорбции белков, проводят избирательное элюирование орготеина иэ колонки при помощи водного элюента, величина рН которого составляет примерно 6, например находится в преде лах между 5,7 и 6,3 и с таким варьированием ионной силы, чтобы элюирование адсорбировавшихся белков происходило последовательно. Для этого используют буферный раствор.с ионйой силой около 0,001-0,005М для элюирования легко элюирующихся белковых смесей, примерно 0,02-0,03М для элюирования орготеина и примерно 0,1—

2,ON для освобождения колонки от остаточ30

ых белковых примесей.

Определение фракции элюата, содержащей чистый орготеин, осуществляют путем измерения оптической плотности элюата при

)длине волны 280 ммк и 265 ммк.

Начало отбора фракции элюата, содержащей существенные количества меди и цинка считают началом отбора фракции орготеина, если в качестве исходного материала

40 применяют растворимые белки тканей животных, Окончание отбора фракции орготеина оп- ° ределяют по резкому снижению содержания меди и цинка и по резкому повышению on-, 4 тической плотности при длине волны 265 или 280 ммк.

Чистый орготеин может быть получен гермической обработкой предварительно очибО щенного на ДЭАЭ-целлюлозе орготеина.

Орготеин экстра-чистоты получают из выделенного на ДЭАЭ целлюлозе орготеина путем последующей термической обработки части элюата, содержащего орготеин, ионы двухвалентной меди и ионы двухвалентного цинка, например, при температуре 65-75 С в течение 15 мин, при величине рН 5,8 с последующим центрифугированием и диалиэом, путем повторной ионообменивающеи, 1хроматографической очистки на ДЭАЭ-цел5) 3595 люлоэе или путем обработки протеолитичео- ким энэимом

П р и. м е р 1. Орготеин иэ печени быка, Печень быка (212г) нарезают на полоски шириной 2 см, удаляют соединительную ткань и кровеносные сосуды, промывают для удаления крови и гомогенизируют при максимальной скорости в быстроходном смесителе, используя на 1 кг печени 3,8 мл трис-глицинового с НС8 буферного раствора с рН 7, 5,03М по свхароэе и 0,05М о по НС8. Затем центрифугируют при 0 С

60 мин. 1 ентрифугат отделяют, производят диалиэ верхнего слоя жидкости с использованием фосфатного (0,005N) буферного раствора с величиной рН, равной 6,0. Затем снова центрифугируют и фильтруют через микропористый фильтр ("версанор") для получения прозрачного раствора. фильтрвт вносят непосредственно в ионообмениваюшую колонку диэтилвминоэтил-целлюлозы (около 40г, 2,5 см х 40 см). Колонку промывают (скорость течения 200 мл/час) при помоши 1 л фосфатного буферного раствора (0,005N, рН 6,0) и затем четырьмя литрами того же буферного раствора, содержашего хлористый натрий в количестве постоянно и постепенно возрастающем .в интервале от 0 до 7,5x10 N, при скорости течения 200 мл/час. При этом производят непрерывное измерение оптической плотности А и А элюата и постоянный контроль содержайия меди и цинка с использованием метода адсорбционной спектрофотометрии.

После. отбора 1 л элюата, не содержащего хлористый натрий, собирают 750 мл элюатв, содержащего постепенно возрастающие количества хлористого натрия или хлористого калия, и этот момент времени молярность постепенно достигает величины

0,018М, величины оптической плотности

А и А о уменьшаются до низких величин, а содержание меди и цинка резко возрастает. После этого собирают элюат и отбор его ведут до тех пор, пока содержание меди снова снизится до минимального, в молярность достигает величины около 2,8х10 2М (550 мл элювта,который содержит 240 мг орготеинв высокой сте;пени чистоты), Чем меньше фракция, отбираемая из этой порции элюата, тем больше степень чистоты присутствующего в ней и выделяемого из него орготеина и тем меньше его выход.

Орготеин наивысшей степени чистоты присутствует в элюате, ионная сила которого составляет примерно 0,022М (при общем объеме элюата 950 мл}. В этой точке кривые поглощения меди и цинка име.ь ют максимумы.

Дивлиэ фракции, находяшейся в интервале объема отбирвемого элюатв от "750 до

1300 мл, производимый с использованием воды до снижения проводимости до 0,04М, фильтрование через микропористый фильтр ,и лиофилизвция, проводимая в стерильных словиях, предпочтительно после смешения, © римерно вдвое большим весовым количестlBoM сахарозы (из расчета нв орготеин), приводят к получению вьщИленного полностью активного, неантигенного, пригодного для инъекций орготеянв, качество которого сравнимо с качеством того же препарата, изготавливаемого в промышленности для испол зования в ветеринарии.

Промывание колонки для удаления не адсорбированных или слабо адсорбировянных белков до элюирования орготеииа осушеств-ляют при постоянной ионной силе, со сту- пенчатым повышением ионной силы или при непрерывном повышении ионной силы, напри мер путем элюирования колонки буферным раствором с ионной силой, на одяшимся в интервале между, примерно, 0,012М и, при мерно, 0,015М, производимым до тех пор, пока величины оптической плотности А„ц, и А не снизятся до минимальных нвчений, с последуюшим элюироввнием орготеина при постоянной величине ионной силы, при ступенчатом повышении ионной силы, илн при непрерывном повышении ионной силы в пределах между, примерно, 0,018М и, примерно, 0,028М.

3S

Затем колонку освобождают от остаточных вдсорбироввнных белков путем повышения ионной силы элюента до величины окь« ло О, 1М или выше.

При применении способа, описанного в примере 1, сходные результаты были получены при использовании в качестве вдсорбентов ТЭАЭ-целлюлозы и имеюшей поперечные связи декстрановой смолы, содержашей диэтилвминоэтильные группы, При применении способа, описышого в примере 1, сходные результаты получены, когда в качестве исходного материала при-. меняют растворимые белки, выделенные со ответственно, из тканей бычьего мозга, почек, селезенки, легких, семенников, поджелудочной железы, тнмуса, мышц и тех же тканей свиной, лошадей, овец и цыплят.

Пример 2. Орготеин из бычьей крови. Свежую бычью кровь (870 мл) собирают в 3,8%-ном растворе цитратв иятрия (0,5 объем/объем). Боитрифугирунзт при скорости врашения центрифуги, сооч ветствуK)513595

Формула изобретения

Составитель Т. Серебренникова

Редактор В. Смирягина Техред H. Ковач Корректор Л. Анджиевская

Заказ 431/11 Тираж 629 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101 шей 4000 об/мин, прп температуре ОоС, )

Плазму отбрасывают и консервированные красные клетки (ККК) промывают 3 порциями 0,9 /-ного физиологического раствора.

ККК подвергают лизису путем пятиминутной обработки ультразвуком при комнатной температуре.

После этого проводят диализ, помещая по другую сторону мембраны сначала дистил- лированную воду, а затем - 0,005М фосфатный буферный раствор с рН 6,0 в течео ние 24 час при температуре 4 С (четыре замены второй жидкости, объем каждой порции 4 л); увеличение объема соответствует

1 107. !

Подвергшийся диализу экстракт вносят в колонку (2,5х30 см) ДЭАЭ-целлюлозы, приведенной в состояние равновесия с 0,005М фосфатным буферным раствором (рН 6,0).

Колонку промывают при скорости течения

240 мл/час при помощи 0,005М фосфатного буферного раствора. Большая часть гемоглобина появляется при истечении объема элюента, соответствующего объему колонки, а остальную часть удаляют при ââ денни дополнительных 250 мл элюента (общий объем 450 мл).

Элюирование орготеина осуществляют при помощи 4 литров того же буферного растора с повышающейся концентрацией .хлорисого натрия в пределах от 0 до 0,08М.

Измерение содержания меди и цинка и оптической плотности элюата А и А производят также как в примере 1.

Диализ отобранной фракции, содержащей орготеин, проводят, помещая по другую сторону мембраны депонизированную воду, до установления проводимости, равной, примерно, 0,3-0,45 мком (обратные микроомы), фильтруют через фильтр с порами в 0,45 мк и лиофилизируют.

При этом получают примерно 52 мг ор-. готеина, выход которого составляет 0,0133 из расчета на консервированные красные клетки; активность, из расчета на содазу, составляет 2500 единиц/мг, что соответствует 75% обшей активности орготеина, как перекисной дисмутазы, первоначально присутствующей в продукте лизиса.

Колонку регенирируют для повторного применения путем промывания ее буферным раствором, ионная сила которого составляет, по меньшей мере, 0 1М и доходит до

2М с. последующим ополаскиванием депонизировояной водой.

При применении способа, описанного в примере 2, чистый орготеин выделяют из красных кровяных клеток человека, кроли- ков, крыс и цыплят.

При применении способа, описанного в примере 2, сходные результаты получены при использовании ТЭАЭ-целлюлозы и имеющей поперечные связи декстрановой смолы, содержащей дизтиламинозтильные группы.

Способ выделения орготеина путем хроматографического фракционированпя на ионообменных смолах орготеинсодержашего мат (sana, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, адсорбцию орготеинсодержашего материала осуществляют на дизтиламинозтил- и триэтиламиноэтил-целлюлозе при рН 6,0, элюируют буферным раствором с ионной силой не более 0,02М с последующей десорбцией целевого продукта градиентным. буферным раствором с ионной силой 0,02-0,03М с отделением фракций элюата с оптической плотностью А 6 или А ВО, содержащих двухвалентные йоны медй й/или цинка.