Способ получения фермента,фиксированного на твердом носителе

Способ получения фермента,фиксированного на твердом носителе

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Республик (61).(ополнительный к патенту (22) Заявлено „4 11 78 (21) 19 59515/1д (23) Приоритет — (32): 5.11.; 2 (31) 7 24049 2 (33) Франция (43) Опубликовано 25.О5,76.Бюл -.етень М (45) Дата опубликования описачкя 1 4.10

j ( (51)

l9 (53)

-Р Q

Государственный нсмнтет

Сената Инннстрвв СССР пв делам нзввретеннй н втнрьпнй, т ДК 577.15.08 (088.8) Иностранць.

Жан Поль Бурдо, Жан Луи Серис, Рене Порнэн и Пьер Фоссати (72) Авторы изобретенио, (Ф ра;п »ля ) Иностранная фир ма

Сосьете Насьональ де Петроль дт Акитэн" (Франция) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИН ФЕг у Р j ., л.-И1 (-ИРррАННОГО

НЛ ТВЕРДОМ НОСИТЕЛЕ

Изобретение относится к ферментной промышленности и касается способов получения фермента, в частности сычужного, используемого для приготовления сыра, фиксирован»o— го на твердом носителе. Фиксирование фер= с ментов на твердом носителе дает возмож— ность, с одной стороны, обеспечить чистоту готового продукта путем вывода зафиксиро— ванных ферментов из среды после окончания процесса, а с другой — расходовать фермен- М ты экономно.

Известны различные способы фиксирования ферментов на твердом носителе. Известен способ, согласно которому осуществляют диспергирование целлюлозы в буферном раство- 15 ре фермента при рН 5,0-10,0 и температу— ре 0-45 С, а затем отделяют целлюлозу с фиксированным ферментом и промывают ее 1)1. Однако такой способ не обеспечивает получения достаточно активных и стойкчх 20 ферментов.

Согласно предложенному способу с целью повышения активности и стойкости фермен— тов используют целлюлозу, содержащую ь своей молекуле Do 7% серы в виде окислов 25 и/или до 4% хлора, причем при использовании нелл..олозы, содержащей серу и хлор, содержание хлора в молекуле целлюлозы ниже содержа»л я в ней серы.

Применяемая согласно этому способу цел-люлоза должна содержать от 5 до 25 вес.% лигнина, диспергнрованпого в ее массе.

Настоящее изобретение позволяет осутлест— влять фиксацию различных ферментов, в частности, IIpOTEGG (H B x OM IHCJIP. Cb! KHOFO фермента) на целлюлозе и получать при этом твердые комплексные соединения, не растворимые в воде, стабильные, с хорошей фер— ментативной активностью. Использование предлагаемого споссба позволит получать продукт, свободный от ферментов, и иметь значительную зкономию последних.

Сульфо и/или хлор-целлюлозы, пригодные для осуществления предлагаемого способа, получают с помощью любых известных хлорирлонплх агентов, í"-пример хлористым фосфором P СO, P С, оксалилхлоридом, сукциноилом или другой органической кислотой и в особенности сульфохлорированными агентами.

1 5>460 сЦеллюлозу предве(>11тепье(О обрабатывают

ЩЕЛОЧНЫМ РЯСТВОРОМ> .=6. ГЕКI ПРОМЬЕВЯЕ>> . И диспергируют в органической жидкости (неитральной или слебоосновной), После введе— ния агента хлорирования В дисперсию целлюлозы В течение нескольких часов при темпе»о

pQIvpe предпочтительно 10-55 С осущест

Л в11111О>- выдержку реагирующих систем, а затем целлюлозу выделяют, промывают и при необходимости -y ua ò. Uen(сообразнее досяв-лять х>ЕОрируепп(ий агент к дистерсии Bell>IIG-.

Л ОЗ Ь1 НОС Г(= 1 1ЕН О.

Зятем осуществляеот ко такт обработап— ной целлюлозы с буферным раствором фер— мента при рН последнего 5,0-10,0 и тем(Е

Ееерятъре ниже 45 О. Длительность коптак,тя ."1,>ея фикся111>и фермента на целлюлозе 2448 ч"-е(,ОЛЕЕЧЕСтво РаСХОДУЕМОГп фЕРМЕНта К ВЕсу активирпванной целлеелозь1 составляет

1 60 Вес»>, К ГРУППЕ фЕРМЕ1> ГОН, СПОСПОЕЕЫХ Паreат i кОмппексн>:Ie сО(.дине;1ия с ективиройаннои целлюл(iзо1(, Относите!1 ИHBepòa(>Q,:ë(ènaça> мальте(1(1 Пектип -a ., Лр .тЕаэы, пептидазь, трипсин, химотрип сии> -»Iso(II(: „фпсфптязы, рибонуклеазы. Особое место з> нимяют сычужный февмент, бет(-гелакт >да">Q и химотри псин..1>(елателе-,е(о, «т>бабье r елю(еозныйе носител1 содержал сжо ео 5-25;е-: лигнина по

Весу сухпГ. Вещества,,"(ля получения такой пепл>олпз>и МОжнО испОльзова Гь пеепу Опил» ки, сп:>o лу, а также бумажную массу при

УСЛОВИИ СОДЕРЖЯНИЯ ПИГЕЕИНЯ В УКЯЗЯПНЫХ пределах. Можно применять также сгержни

ПОН(1ткя кукурузе>1 Г аз :!ер часГЧИ ПРллю Io зы — пт 0,2 мм до нескп;>ьк>ех callтиметров (предпочтительно О, 5-5 мм ) .

Наиболее хорошие результаты получают

Есри использовании стержней почате(е кукуру-зы В кусках 0,5-10 мм, обработанных хлсридом тионила в присутствии избытка пири° r, диня и содержащих В готовом виде 2 — 6 серы и хлора менее 1 %.

>тоб1,I ПОлучиГь фРрмРнт, фиксирОВЯ1>ный ня лигнифицировянпой целлеолозе, ппслелнкпо (соцссрж(>1>11>10 лигеЕин ) измельчают получ =H— ные куски Обрабатывают вначале (ееелочньГм раствором, растворяя находящийся на их поверх>1(>сти лигнин, затем куски (зерна) цел-люлозы промывак>т холодной Водой, обсзвоживают спиртом и иром.ьвают пиридином, Вводя В суспензию хлорид тионила и педлер-о живая температуру ня уровне 55-60 С, ОГ.у тя sac суспензию Охлаждают, Вьеделяеот зерна, промывают водой, затем раствором кислоты с рН близким к 2,0 спиртом и суп ят при температуре ниже 50 С.

Нанесение фермента на полученньей н тель осуществляют в среде буферного водного раствора при рН 5,9-6,4. и температуре

2 1-... .(." (..". тече;- Ie 2-. час. Затем зерна с . »;".(1> ..»Ьг»Е>Е,>МЕПтОМ ВЬДЕе1ЕЯЮт, ПромЫВавт буг ерным раствором с соответствующим рН п.водой. Хране(ть полученные зерна рекомендуется при относительно низкой температуре

В буферном растворе при рН, обеспечиваюue1(устойчивость фермента.

П р и м е;.: 1. Хлорирование целлю—

""îçû В присутствии пиридина, 1еетелюло(;у- В количестве 32,4 r обра(:.;тывааи 18 >ж-ееым водным раствором гидро(»(иси (еа->ри - — течеиие 2 час. Затем ее промывали мета1;Олом до тех пор, пока

Филь 1раты пер(- "с Гя(1ут Оы > ь ОснОВ>Iыми и пиридином. После этого ее суспендируют в 800 м; пирид::н .. К суспензии добавляеет 146 мл хлориды тиониля (чистотой

99". > Остявп((ЕОт в покое 4 час, поддеро живая 28 С. Спустя этo Время получен— ную смесь вносят в Ванну ледяной воды

;> п>е1>еме>нивак т 1 чяс, ЗятРм целлк>лозу птфи, >-тр>:- = H,aaaòã:(:".Отовят из нее и из п>асгво -, 1(олуне - >щенного двууглекислого натрия (. > сп(»з .>О, которую через сутки промывают Надои. ПО11 >ченную целлюлозу сушат 24 е."". Нри 50 О Б ней содержится 3,57 о хпо,> и 4,4% серы.

Опытами,."..-:..:Иовлено> что в среде пиридина сера фиксируется на целлюлозе в течение первог(. часа реакции и если опе,о рацию продолжать при 28 С, то содержание ее понижается К(1личество фиксиро—

Вя1111ого хлора наоборот 11свышается спустя

" - РЕ- - 1

Пример 2. Хп(орирование целлюлозы в присутствии д(н к(> на, Готовят суспензию .;:-. 6."; г целлюлозы и 450 мл диоксана. ДО(>аь. яют 30 мл хлоп идя Гио(>ила 1 (Осл>: 1.

-.ИГЕьтруют, нро:.: .,:в- ioI В,.:. и сушат. Соде11жание хлора В целлюлоз 1 5 1 %. Если повысить количество хлорида тионила при получении реакционной смеси (или время реакции), то содержание хлора В целлюлозе не увеличивается.

П р и м e p 3. Обработка целлюлозы хлористым суль>е>ирилОм, Обработку целлюлозы ведут аналогично примеру 1, но Вме(-..то пиридина использукт 44 мл хлористого сульфурила, т. е.

3,50 моля.

Пример 4. Обработка целлюлозы в присутствии трихлорида фосфора.

Обработку целлюлозы ведут аналогично примеру 3, но используют 50 мл трихлорида фосфора, т. е, 0,6 моля, Пример 5. Обработка целлюлозы пентахлоридом фосфора.

Процесс осуществляют аналогично примеру 4-, но используют 62,5 г пентахлорида фосфора или 0,3 моля, предварительно растворенного в диоксане. Таким образом, используют оцновременно пирид-.Н и диоксан.

Пример 6. Приготовление комплексного соединения целлюлоза-сычужный фермент.

Сульфо-хлорированную пеллюлозу в количестве 16 г, согласно 11римеру 1, вводят в контакт с 40 мл раствора промышленного сычужного фермента, разбавленного пятикратным количеством буферного раствора

10 фосфата при рН 6,2. Поддерживают темпео ратуру между 4 и 6 С при перементивании.

Спуотя 48 час целлюлозу промывают в

250 мл буферного раствора фосфатг при рН 6,2 250 мл вагонного раствора хлорист2

Е

ГО натрия (5 молей/питр) и 250 мл во22ы.

Затем комплексное соединеггие снова суспендируют в 250 мл буферного раствсуа ацетата при рН 4,4„температуре 4-6 С и перемешивании в течение 1 час.

Эту обработку проводят- для десорбции ковапентной связью не фиксированной фракции фермента. После новой фильтрации не растворенный фермент возвращают и суспенцируют с 250 мл буферного раствора

Ж ацетата в течение 20 час. После послед— ней фильтрации полученное комплексное соединение целлюлоза-сычужный фермент диспергируют в 100 мл этого буферного раствора ацетата НрН рН 4,4 и оно сохраняется В хОлодильнике IIpH 4-6 С. АктивнОС гь

16 г этого комплексного соединения эквивалентна 0,12 мл промы1пленного сычужного фермента.

Пример 7. Комплексное соединение

ЗЬ целлюлоза-хим Отрипсин.

BB03Rr B трубки HG пластмассы IIIII 2IBIIтрифуги 500 мг целлюлозы, с21-.аботанной согласно примеру 2, добавляют 10 ллп буферного ферментативного раствора при рН 9 (борная кислота, /хлористый калий/ хлористый натрий), обозначенного маркой "титризоп . Трубки помещают на виброщит на 10 мин при комнатной температуре. Затем процс изводят их центрифугирование в течение

20 мин сп скоростью 2500 об/мин. Уда— ляют всплывшую часть, осадок .тромывают для десорбции части фермента, которая не фиксировалась, 10 мл раствора хлористого натрия, содержащего 5 молей хлористого натрия на 1 и, После перемешивания снова производят центрифугирование в течение

20 мин. Остаток обрабатывают буферным раствором при рН 8,5, известным под названием "трис, состоящим из амино-2 гидроксиметил-2 пропандиол-1,3, и 10 мл титризола при рН 9.

Проводят еще две промывки, после чего обработанную целлюлозу сушат.

Протеолитическая активность полученно- @

Г -,. Г с; О О;»ОМГ2Л» „-ОНОГО СОЕДИНЕНИЯ ОГГРЕ депяется кг хазе-:п2e ггои ph 8.5 и темпе6 ратуре 37 С, Дпя этого в ко12ическую колбу вносят 800 мг комплексного соедине— ния и 20 мл раствора казеина (или снятого молока), спустя 10 мнн отбирают 10мл раствора, который выливают в г робирку, содержащую 10 мл трнхлоруксусной кислоты для остановки реакции. Затем 12робир— ку помешают на 1/2 час в ванну, где Iiog о дерхжвгют 37 С, для Осаждения всего казенка, который не был гицролизован. Фильтруют и опрецеляют количество выделен— ного тирозина измерением оптической плотности фипьтратг при длине волны 2750Я.

Таким Образом„. находят, что активность

500 мг комплексного соединения целлюлозахимотрипсина саавнимг с активностью

0,8 мг свобод11ОГО трипскна по отношению к 10 мл снятого молока в тех же усло—

Пример 8. Комплексное соеди11ение трипсин-пеллюлозг.

Г IIOCH ÃeËß, 1ЖИГО ГОВЛРННОГО СОГпасно примеру 2, вводят в коническу1О колбу с 80 мп ферментат1лвного раствора, содержащего 200 мг трипсипа и 100 мл буферного раствора титризола при рН 9. Перемешивают B термсстате и осгавл1пст на

10 мин ггпг 37 С. ЗгтР.,; фильтруют на фРИТИР ОВг Н11ОМ i "ГР1»ЛЕ l. ПРОМ ЬIВ г К2т K O »I плексное соед1121ени= 70 мл водного раствора с 5 мол2ям11 хлористого 1.гтр1111 11г

1 л. Вторую и третью ппомынкн::Р12ио:-2я>

coo rBerc.гвенпО с 50 и 30 х!л r;!I О ж»: ра "вора хлористого ьг2трия. Полчче112 ио комплексное Ро.-=ди" е1Ь1е ссхт2г12ягот A б-« ферном pa2-rBope "тряс" при рН 8.5. Протеолитическая активность 500 мг комплекСКОГО соедиl! Р11гл= .„О1 Bеделpггная нг казе2п1Р при рН 8,5 и 37 С, соответствует активности 0,4 мг свободного трипс1л1-г, Пример 9. Комплексное соединение бета-гала ктозндаза-целлюлоза.

K 13 Г модифицированной согласно ïpHмеру 1 целлюлозы добавлчюг 4-0 мл ферментативного раствора. разбавленного в 10 мл буферного раствора при рН 7„2, состоящего из 10 моль/л фойгта калия и 10

-г -1 моль/и хлористого магния. Фермент 2тивньгй раствор представляет собой деллюларный экстракт ЕясЬе .@а о. Сой» К 1 2, очищенный путем осаждения сульфатом аммония, содержащий 1800 ед. О-нитрофенил-бета-Д вЂ” галактопиранозида (О. Н. П. Г.).

Перемешива.от смесь в течение 48 час при о

40 С. По".Ле первой фильтрации комплексное соединение промывают и счспендируют5 1 54613

ЫНИИПИ Заказ 1981/237 1ираж 576 11од;шсное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 в следуюших растворах, 1-. жопа ? ч0 ."ië

Буферньп раствор фосфат.1 при рП 62 150 мч

2. Хлористьгй натрий 5 молей/л пои рН 6,2 150 мч

Вода 150 мл

3. Буферный раствор фосфата 1 50 мл

Фермент, фиксировагпний на носителе цел-люлозь, сохраняется .: буферном растворе

° : р фосфата прп р" 1 6,2, хтиглн ость комплехсн -...-о соединения, г!сс1уче!и!ого из 13 г 1v.oäIIôèïèpoâàílloé целлюлозы, оценивается на 1000 ед. свободной бета-галактозидазы.

Активность бета-галактозидазы определяеГся ре . "Идролизуюцгим дейГвием HG o-!И-трсх, ссп ".г -бета- П -галактопиранозид (О.

11„П. Г, j которое выявляет желтую окрас— ку в растьоре (0 П. П. Г.), вызванную вьделенным О-нитрофенолом ИзмepIIK à кОличество гглдролизованного О. 11. П. Г. возрастанием опгической плотности при 4,200 Л, При постоянном р11 окраска це изменяется.

11аносили коивые отсче а при р,гзличньгх р11, а активность фермента оп;; деляли изИСХОДНОЙ CKOPOCTII РЕ. KIIVi.

Пример 10. Комплек:,«ое соедипенис. Ог,ггужньгй фермент-древ; инная целлюлоза.

Стержень г!о-гатка кукурузы,, содержа—

;,.-Ий«ог;о.-l 80 ir целлюлозы и ) 5 n JIIIIHIIHB, нзмель IvloI в зерна. от 1,5 до 2,5 мм.

50 г этих зерен помешацот и 18%-ный рас. -»Oo натрия, который перемешивают в точен!«е 15 .лин при обьгчггой температуре.

Затем зерна выггеляют и хорошо промывают хологп Ой водой. Б конце промывают 1 л метанола, затем 400 мп пиридигя. После этого зерг!а перено.:я r в 800 мл пиридинг и перемешивают. Затем туда наливают по

1 00 хпг XJIODHCTOI O TIIOHHJI«I B ленце 15 мин, Температ уа реакционной среды повыгнается до 55 С, и среда внезапно сильно окрашивается. Спустя 1 час после введения хлористого тионила =месь вьлггвают в ванну ледяной воды. Затем зери» выделяют и промывают несколькими литрами воды, раствором хлористого водорода пргг р11 2„ до полного удаления пиридина абсорбировац!!Ого на зернах. Заканчивают пром г ку 1 л метанола, Полученные зер ill о сушат прц 40 С, Обработанная целлюлоза содержит . .", з% серы и только следы хлора.

B 160 мл буферного раствора с фосфа -пми при р11 6,2 вводят 16 г зерен, при"."с. Гоп < "."Лых н ак - казано выше, и 4г.? мл

"г. о"о фег.:ме:. Та„известного поп маркой (!г- лс. ". Все вместе выдер— . O живаю-т при 40 С в течение 24 час при перемен!иванич. Затем выделяют зерна и приступают к десорбпии >жмически нефик— сированного сычужного фермента. Лля этого прОмь«вают г.начала 20 ° мл ГОГО же буферного раствора (как указано выше), !

1ОТОХЛ 2 Л;-, ЛС.;-;Пцт,ЛПОВ;-гг!- -й ВодЬ1 И В КОН« :1

250 мл б, +ернол"o расхгвора ацетата

,,и в!1 -,, + il «1..:е, :.. ОгсвОры этих О1: раоот<.к снова испо гьзуют. Зерна комплексногс соединe..::. =.. -,"А ный фермент-целлюлоза из CIBgwня початка кукурузы сохра— няют 1гри 4 С,ь,- ."? мл буферного раствора а цетата, &1 -;-::o Mïëeêclloå соединение дало отличньге результаты при свертывании молока (8 г соединения, содержащего 0,04 r фиксированного си!нужного фермента, свернули гюи ilellpep =.ганой операции 35 л молока за з ч;=..;.,": !".11а "c=,;.BOKHM свертыванием с разба,-,пением сычужпого фермента I молоке это же количество позволяст свертывать только 0,4 ;,I.

Фермент,= фиксированные на твердом носителе в со: тветствии с изобретением, сохранягот о е;; долгое время (до 2 лет) ферментативную;-,.1тивность, если их подвергать лиофилизации и хранить при низкой

ЗО температуре.

Ф о р м у л а гл .=. o б р е т е н и я

1. СгK Io, полу«el- ".. " фермента, фиксированного на aвердо;л, о!.:. .теле, путем дисцергирования целлюлозы в буферном растворе фермента пои рН 5 0-l О,О и температуре 0-45 С -. последугон;им отделени—

oI,": целлюлозы с фиксирова= .гьгм ферментом и ее про!лывко!л, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с це.IIIo пол гения более активных и стойких ферментов, используют целлголозу, содержащую в своей молекуле до 7% серы в виде окислов и или до 4% хлора,. причем пр!л использовании целлюлозы, содержащей серу и хлор, содержание хлора в молекуле целлюлозы ниже содержания серы.

2. Способ по и. 1, отличаю— шийся тем, что целлюлоза содержит

@,, 5-25 вес. % лигнипа, диспергированного в ее массе.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

65 1. Патент Франции %2073902 от

01,10,71.