Способ биосинтеза амидаз

Способ биосинтеза амидаз

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А Н И Е р 51578l

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 30.01.74 (21) 1997127, 13 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 30.05.76. Бюллетень № 20

Дата опубликования описания 22.06.76 (51) .Ч. Кл С 12D 13/10

Государственный комитет

Совета Миннстров СССР ло делам изобретений и открытий (53) УДК 577.15.08 (088.8) (72) Авторы изобретения

Д. Д. Штоффер, В. H. Игнатов и А. H. Мешков (71) Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков (54) СПОСОБ БИОСИНТЕЗА АМИДАЗ

Изобретение относится к области микробиологической промышленности, а точнее к биосинтезу амидаз, преимущественно t-аспарагиназы и бензилпенициллинацилазы.

Известен способ биосинтез а амид аз путем непрерывного культивирования аэробных микроорганизмов, например, Escherichia coli на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при аэрации с последующим выделением ферментов из культуральной жидкости.

Недостаток известного способа заключается в том, что проводимый процесс не обладает стабильностью при изменении скорости протока. Кроме того, для культивирования микроорганизмов используют питательную среду на основе дорогостоящего дрожжевого экстракта без сахаров при поддержании в строго определенных концентрациях лимитирующего субстрата, в качестве которого используют промежуточные продукты, например, глюкозу или глицерин, вследствие чего изменение содержания глюкозы в исходной среде с 1,5% до 1,75 / снижает выход продукта на 20 /о, а изменение скорости протока с 0,15 час до

0,28 час — приводит к уменьшению съема фермента в 50 раз.

С целью обеспечения стабильности процесса по предлагаемому. способу культивирование осуществляют при поддержании парциального давления кислорода в среде ие выше 2 MM рт. ст.

Способ осуществляют следующим образом.

Биосинтез амидаз, например l-аспарагиназы и бензилпеницпллинацилазы, проводят в условиях непрерывного одностадпйного культивирования аэробных микроорганизмов, например, Escherichia coli штамм 980, на питательной среде, содержащей источники углерода, 10 азота и минеральные соли, при аэрации с последующим выделением ферментов пз культуральной жидкости. Культивирование осуществляют прп парциональном давлении кислорода в среде не выше 2 мм рт. ст.

15 Способ апробирован в лабораторных условиях.

П р и мер 1. Проводят биосинтез бензилпенициллинацилазы, используя штамм АТСС

9637 Escherichia coli. 14 льт ру поддержива20 ют в пробирках со скошенной агаризованной питательной средой из 2,о (по сухому весу) кукурузного экстракта и 1,5 /о агар-агара.

Пробирки иикубируют 18 час при 37 С.

Засев осуществляют смывом с косяков из

25 расчета 0,12»r клеток (по сухому весу) на

1 мл питательной среды, в качестве которой используют 1 вес. /о раствора кукурузного экстракта с добавлением 0,1 вес. О о фенилуксусной кислоты, рН 7,2 — 7,3 после стерилиза30 ции.

515781

Непрерывное культивирование проводят в аппарате типа MRB при объеме загрузки 1 л при 24 С. Содержание растворенного кислорода определяют датчиком. Поток питательной среды включают в фазе экспоненциального роста культуры через 2 — 4 час после засева.

После включения протока подбирают условия аэрации и перемешивания таким образом, чтобы парциальное давление растворенного кислорода не превышало 2 мм рт. ст. Зтому требованию соответствуют скорость вращения двухлопастной магнитной мешалки 900 об/мин и расход воздуха — 0,8 л/мин.

Непрерывную ферментацию бензилпенициллинацилазы проводят 100 час.

При протоке среды 0,15 час — (150 мл/час) получают культур альную жидкость с содержанием клеток 1,51-0,1 мг/мл с удельной активностью фермента 13,0+-0,5 ед/мг сухого веса клеток, - а при протоке 0 1 час — (100 мл/час) — с содержанием клеток 1,8+

0,1 мг/мл с удельной активностью 16,0+

0,5 ед/мг сухого веса клеток.

Активность фермента определяют модифицированным методом Сватека.

Контрольный периодический процес ьедут

18 час на той же среде и том же посевном материале в колбах Зрленмейера (750 мл) с загрузкой 100 мл стерильной среды при 24 С на круговой качалке при скорости вращения

220 об/мин. К концу процесса получают

3,8 мг/мл клеток с удельной активностью

7,2 ед/мг сухого веса клеток.

Таким образом, производительность непрерывного процесса съема фермента с единицы объема загрузки питательной среды в единицу времени практически не изменяется при изменении протока в 1,5 раза и составляет, примерно, 0,3 ед/мл час против 0,15 ед/мл час в периодическом процессе (без учета времени на подготовку аппарата и ферментации в последнем) .

Удельная активность фермента увсличивается в 2 — 2,5 раза, что способствует повышению производительности íа стадии химической очистки бензилпенициллинацилазы.

Пример 2. Проводят биосинтез l-acnapaVi C It 0, I ha 3I ш та м м 980, Il O;I ii it C H I t Ii1 Й 13 л а бор атор ии культур продуцентов ВНИИА.

Культуру, хранившуюся на мясо-пептонном агаре, используют для за.ева колб с посевной стерильной средой, в качестве которой берут

4 вес. % кукурузного экстракта и 0,1 вес. гидролизата казеина (по аминно»; азоту).

Посевной материал выращивают:„:à круговой качалке (220 об/ IIIII) 15 — 18 ilac при 28 С.

Питательнь1е ферментационные среды засевают посевным матер taлом из расчета 0,1—

05%.

Биосинтез l-аспарагиназы проводят на среде, содержащей 8 вес. % кукурузного экстракта и 0,1 вес. % сульфата аммония, рН стер ил из ации 7,3 — 7,5.

Непрерывное культивирование ведут в ферментере типа Н -103 (Biotes) при объеме за5

4О

65 грузки 2 л при 28 С. Растворенный кислород измсряют с помощь1о прибора LP — 100 — 8 (13iotes) . Проток питательной среды включают в фазе экспоненциального роста культуры через 3 — 5 час после засева. Условия аэрации и перемешивания соответствуют подср>I(ÿíèþ парциа;1ьного давления кислорода в среде не выше 2 мм рт. ст.

Непрерывную ферментацию 1-аспарагиназы проводят 160 час при протоке среды 0,5 час —, расход воздуха 2 л/мин, скорость вращения мешалки 575 об/мип. Получают культуральную ж;1дкость с содержанием клеток 3,3+

0,2 мг/мл (по сухому весу) при удельной активности фермента 1,51-0,1 МЕ/мг клеток lаспарагиназы.

При протоке среды 025 час — (0,5 л/час} поддерживают расход воздуха 2 л/мин и ско. рость вращения мешалки 420 об/мин, при этом получают культуральную жидкость с cojIBprIIанием клетОк 3,51-0,2 мг/MJI (110 сухому весу) при удельной активности фермента 2,810,2 ед/мг сухого веса клеток.

Контрольный периодический процесс проводят в колбах Эрленмейера (750 мл) с загрузкой 100 мл среды при 28 С на круговой качалке при 220 оо/мин. На 15 час культивирования получают 4,1 мг/мл клеток с удельной активностью фермента 1,6 ед/мг сухого веса клеток.

Таким образом, производительность непрерывного процесса практически не изменяется при изменении протока в 2 раза и составляет -2,5 ед/мл в 1 час против 0,65 ед/мл в

1 час при периодической ферментации, т. е. примерно в 4 раза выше, даже без учета времени на вспомогательные операции в последнем.

Пример 3. Процесс биосинтеза l-аспарагиназы ведут, как в примере 2, используя штамм С1 Escherichia coli.

Ферментацию проводят 100 час, последовательно заменяя через каждые 36 час культивирования питательную среду, приготовленную на основе трех различных партий кукурузного экстракта с содержанием углеводов

13 последнем 0,7, 2,4 и 4,2% (по сухому весу экстракта) .

Прп протокс 0,25 час — (0 5 л/час) расход

«оздуха 1,5 л/мин, скорость вращения мешалки -150 об/мин. Получают культуральную жидcacch с содержанием клеток 3,31-0,2 мг/мл (по сухо.1у весу) при удельной активности фсрменга 3,34-0,2 сд/мг сухого веса клеток.

В контрольном периодическом процессе на

18 час культпвпрования получают 3,65 мг/мл клеток с удельпoh активностью 3,8 ед/мг.

П р н м е р 4, Ял;1 биосинтеза 1-аспарагиназь1, спользу1от 3 льтуру Егюп1а carotovora, котоэ»ю . :о iÄ -.О:. Ивают на скошенном мясоl пептонно, Иваре 11 aañåâàþò колбы с посевной стев::;:ьной средой, в качестве последней ис1 пользуют ",%-пый кукурузный экстракт (по техп11ческо31у вс у), 0,1 /о-ный гидролизат казеипа (ilo а»и:;:1ому азоту), Посевной мате515781

Формула изобретения

Составитель А. Бражникова

Редактор Н. Спиридонова Техред М. Семенов Корректор Т. Добровольская

Заказ 1356/15 Изд, Ма 1368 Тираж 575 Подпи".íîñ

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Мшшстров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 5К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 риал выращивают на круговой качалке 15-—

18 час при 37 С. Питательные ферментацнонные среды засевают посевным материалом в количестве 0,1 — 0,5 /о.

Биосинтез /-аспарагиназы проводят на среде, содержащей 8 вес. /, кукурузного экстракта, 0,1 вес. % сульфата аммония, рН для стерилизации 7,5. Непрерывное культивирование ведут в аппарате типа MRB, загружая

1 л при 37 С. Содержание растворенного кислорода контролируют датчиком ВНИИА. Поток питательной среды включают в фазе экспоненциального роста культуры через 5 час после засева. После включения протока устанавливают условия аэрации и перемешивания таким образом, чтобы парциальное давление кислорода не превышало 2 мм рт. ст. В данном примере этому соответствует скорость вращения мешалки 1100 об/мин и расход воздуха 1 л/мин. Непрерывную ферментацию проводят 120 час.

При потоке среды 0,5 час — (500 мл/час) получают культуральную жидкость с содержанием клеток 1,3 1-0,1 мг/мл с удельной активностью фермента 9,011-0,5 ед/мг сухого веса клеток. При протоках 0,25 час — и

0,15 час — содержание клеток в вытекающей культур альной жидкости 1,8+-0,1 мг/мл с удельной активностью 12,0+1-0,5 ед/мг сухого веса клеток и 18,54-0,5 ед/мг сухого веса клеток, соответственно.

1о.tòðî tüíûè:t ttI.ït:o;tический процесс ведут 15 и; в колба. 31ленмейера сбьемом

750 мл, загружая 100 мл стерильной среды при 37"С на кр1товой качалиe. K конц; процесса получают клетки концентрации

2,5 мг/мл с удельной активность1о 7,8 ед/мг (сухого веса) .

Таким обра"-ом, производительность непрерывного процесса не изменяется прп колебаниях состава питательной среды и составляет

2,7 ед/мл час против 0,8 ед/мл час прп периодической ферментации, т. е. в 3,5 раза выше (без учета времени. необходимого для подготовки аппарата к ферментации в периодиче15 ском процессе) .

Способ бпоспнтеза амидаз путем непрерывного культивирования аэробных микроорганизмов, например, Евс1 ег1с1иа coli на питательной среде, содержащей источники угле25 рода, азота п минеральные соли. при аэрации с последующим выделением ферментов пз культуральной жидкости, о т л и ч а 10 щ п и с я тем, что, с целью обеспечения стабильности процесса, культивирование осуществля|от при

30 поддержании парциального давления кислорода в среде пе выше 2 мм рт. ст.