Штамм вниигенетика-225-5,продуцирующий 5" инозиновую кислоту

Штамм вниигенетика-225-5,продуцирующий 5" инозиновую кислоту

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПИСАНИЕ

ИЗСБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ((() 5I5783

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 23.10.74 (21) 2071155/13 с присоединением заявки Ме (23) Приоритет

Опубликовано 30.05.76. Бюллетень Х 20

Дата опубликования описания 22.06.76 (51) М. Кл."- С 12К 1 02

С 12Р 13/06

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изооретений и открытий (53) УДК 663.131(088.8) (72) Авторы изооретсння

A. Л. Нудлер, Л. И. Ерохина, H. В. Магвейчук и А. Ф. Шолин (71) Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (54) HITAMM BREVIBACTERIUM AMMGNIAGENES

В Н И И Г Е Н ЕТ И КА-225-5, II Р ОДУ ЦИ Р УЮ ЩИ 14

5 -ИНОЗИНОВУЮ КИСЛОТУ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового штамма Brevibacterium ammoniagenes

ВНИИгенетика-225-5, продуцирующего 5 инозиновую кислоту, используемую в фармакологии и пищевой промышленности для повышения вкусовых качеств продуктов питания.

Известно несколько способов промышленного производства инозиновой кислоты: двухступенчатый способ биосинтеза инозиновой кис- 10 лоты с использованием основания (гипоксантина) или нуклеозпда (инозина); путем совместного выращивания двух бактериальных культур, одна из которых продуцирует предшественник, а другая фосфоримерует его до 15 инозиновой кислоты.

Кроме того, имеется штамм Micrococcus

glutamicus Fen-79, продуцирующий инозиновую кислоту. Однако недостатком этого штамма является невысокий у ровень его активно- 20 сти.

Известен штамм КУ 13102 (Applied М1сгоbiology, 1968 г., рр 981 — 987), способный продуцировать до 7 г/л инозиновой кислоты. Однако как и все другие штаммы, этот штамм 25 обладает неустойчивой активностью при повышенном содержании ионов Мп++, так при

100 мкг/л ионов Мп++ в культуральной жидкости штамм синтезирует всего около 1 г/л инозиновой кислоты. 30

Цель изобретения — создание такого штамма-продуцента, которой обладал бы высоким уровнем бпосинтеза пнозпновой кислоты, а также устойчивостью ее накопления при повышенных концентрациях ионов Мп++ в ферментационной среде.

Предлагаемый штамм Brew(bacterium ammoniagencs ВНИИгенстпка-225-5 получен из природного штамма Brew(bacterium ammoniagenes АТСС 6872, прототрофа, не продуцпрующего пнозиновую кислоту под действием мутагена и-мстил-а-пптро- г-нитрозогуанидина в результате приобретения двуi последовательных мутаций: потребности в аденпне; способности усваивать нуклеотиды (аденозин-5 -монофосфорнуlo кислоту) в качестве источника аденина.

Штамм имеет следующие свойства.

Морфологические свойства. Штамм ВНИИ генетика-225-5 представляет собой грамположительную палочку, без жгутиков, неподвижную; длина 1,5 — 2u. ширина 0,6 — 1,0ц; спор не образует.

Культуральные и физиологические признаки. Мелкие колонии образуются на мясо-пепToHHoN агаре (МПА) при пнкубацип в течение 48 ч (при 28 — 30 С); колонии диаметром

l — 1,5 мм круглой формы, сплошные с ровным краем, бледно-желтого цвета. Поверхность

515783 гладкая, блестящая, со слабой концентрической исчерченностью.

Посев штрихом на МПА. При инкубации в течение 24 ч при 28 — 30 С, рост умеренный, край гладкий, блеск влажный, жирный, поверхность гладкая, на свет не просвечивает, цвет бледно-желтый, консистенция маслянистая.

Посев уколом. Рост на поверхности, по длине укола рост отсутствует. В МПБ при инкубации в течение 24 ч при 28 — 30 С без встряхивания — слабое помутнение; на поверхности не образуется пленка, при встряхивании на качалке помутнение сильное. При стоянии образуется осадок бледно-желтого цвета.

Агаризованная среда Хоттингера. При пересеве на среду Хоттингера отдельных колоний, выросших на синтетической минимальной среде (состав приведен ниже), через 5 — 7 суток инкубации при 20 — 30 С образуется краснобурый пигмент, Состав синтетической минимальной среды (на 1 л) 10

25

35

При приготовлении агаризованной среды добавляют агар — агар — 20 г.

Агаризованная синтетическая минимальная среда. Рост отсутствует, нуждается в добавке аденина, при добавлении аденина (0,2—

0,5 млц) рост в течение двух суток при 30 С.

Колонии сплошные, круглые, блестящие, с ровным краем, цвет бледно-желтый, диаметром 0,5 — 0,8 мм. При добавлении аденин-5монофосфорной кислоты штамм образует мелкие колонии диаметром 0,2 — 0,3 на 4 — 5 сутки роста при 28 — 30 С.

Жидкая синтетическая минимальная среда с добавлением аденина. Рост в течение 24 ч при 28 — 30 С с интенсивной аэрацией. Помутнение сильное, запах отсутствует. В отличие от штамма АТСС 6872, штамм ВНИИгенетика-225-5 не образует осадка в течение 3 — 5 ч стояния и суспензия не просветляется.

На ломтиках картофеля рост обильный, после инкубации в течение 24 ч при 28 — 30 С, цвет культуры зеленовато-желтый. Пигмент на картофеле не образуется.

50

Глюкоза, г

Мочевина, г (стерилизуется отдельно) (NH4)ISO., г

КН Р04 г

К НРО, r

MgSO4 ° 7Н О> r

СаС1> 2Н О, мг

FeSO4.7Н О, мг

МпС1 4Н О, мг

Аденин, млм

Цистеин, мг

Тиамин, мг

Пантотенат Са, мг

Биотин, мкг

Вода, л рН

0,3

10

3,6

0,2 — 0,5

10

30 до 1

7,0 — 7,3

20

Биохимические свойства.

Желатину разжижает слабо.

На крахмальном агаре роста нет.

На молоке рост отсутствует, свертывания и пептонизации нет.

Клетчатку не разрушает и не усваивает.

Крахмал не гидролизует и не усваивает.

Нитраты не восстанавливает.

Отношение к углеводам.

Глюкозу, фруктозу усваивает.

Лактозу и галактозу не сбраживает.

Оптимальный рост при 28 — 30 С.

Выход 5 инозиновой — 6 — 8 г/л.

Штамм ВНИИгенетика-225-5 является ауксотрофом по аденину.

Антагонистических свойств не обнаружено.

Хранят штамм B виде лиофильно высушенных культур в стеклянных ампулах, а также на агаре Хоттингера под вазелиновым маслом.

Пример. Использование штамма для получения инозиновой кислоты.

Для выращивания посевного материала и процесса ферментации штамма ВНИИгенетика-225-5 применялись следующие питательные среды.

Среда для выращивания посевного материала, г/л:

Дрожжевой экстракт 10,0

Пептон 10,0

Глюкоза 20,0

NaC1 2,0

Н О до1л рН 7,2 — 7,3

Среда для процесса ферментации, г/л

КН2Р04 10,0

К2НРО4 10,0

MgSO4 ° 7Н О 10,0

СаС1> 2Н О 0,1

FeSO4 7Н О 0,01

Мочевина 6,0

Цистеин 0,02

Тиамин 0,05

Никотиная кислота 0,05

Пантотенат кальция 0,01

LllSO4 7Н О 0,001 Биотин 3 10

МпС1 4Н О 0,001 Аденин 0,04

Глюкоз а 100,0 дистиллированная до 1 л рН 8,3

Для засева посевной среды используют суточную культуру штамма ВНИИгенетика-225-2, выращенную на агаризованной среде Хоттингера. Посевной материал выращивают в колбах на качалке 200 — 220 об/мин в течение суток при 28 — 30 С. Для засева ферментационной среды используют 2 — 4О/о посевного материала, и 30 мл среды помещают в колбу Эрленмейера емкостью 250 мл. Процесс ферментации проводят на качалке при 28 — 30 С. Через 6 суток ферментации уровень накопления инозиновой кислоты в культуральной жидкости составляет 6 — 8 г/л.

515783 изобретения

Формула

Составитель М Ларина

Техред М. Семенов Корректор Т. Добровольск".q

Редактор В. Блохина

Заказ 1356/17 Изд. № 1368 Тираж 575 Подппс . с

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4, 5

Типография, пр. Сапунова, 2

Инозиновую кислоту определяют методом хроматографии на бумаге в системе растворителей Н-пропанол-аммиак-вода (6: 3: 1) используя стандартные растворы чистого препарата динатриевой соли инозиновой кислоты Х7НзО. Для анализа используют пластинки «Silufol» с тонким слосм силикагеля и люминофора на алюминиевой фольге.

Выделение инозиновой кислоты из культуральной жидкости.

В нагретую до 70 С культу ральную жидкость добавляют окись кальция в количестве 2%.

Затем рН раствора доводят до 6,0 концентрированной ортофосфорной кислотой и биомассу отфильтровывают. Фильтрат. пропуска- 15 ют через колонку с макропористым ионосорбентом ИА-1. Десорбцию нуклеотида проводят 0,3 н. НС1. С целью нейтрализации солянокислый элюат, содержащий инозиновую кислоту, пропускают через колонку с анионитом 20

ЭДЭ-10 (в ОН-форме). Фракции, содержащие кислоту, объединяют и концентрируют в вакууме при 50 С. К концентрату при рН 8 — 9 добавляют четырехкратное количество этилового спирта, осадок перекристаллизовывают 25 из раствора С2НзОН: 0,1 í. NaOH: Н20 — 2: 1:

: 1. Полученные кристаллы идентифицируют с помощью УФ-спектров поглощения, а также путем разложения выделенного кристаллического вещества. 30

Выделенное вещество (инозин) гидролизуют в 1 н. НС1 в течение 1 ч. Полученные соединения идентифицируют как гипоксантил (основание, входящее в состав инозина и кислоты) с помощью хроматографии на бумаге в 35 трех указанных выше системах растворителей.

Штамм Brevibacte(ium ammoniage13es ВНИИ генетика-225-5, продуцирующий 5 -инозиновую кислоту. Хранится в музее культур института

«ВНИИгенетика», регистрационный номер

В-1073. 45

1 ср(вp l(ч f;, с (О((-, я(;ff 11я;G!(<а (ряба(вЂ

ПO.IG "((Тс,! н l, . 1. C(lодв(1>1;l. 3. ., !>".. :. (C >03(0.6 —-1,0X1,5 — 2!!. Спор не обр((зует.

Культур яльные н а(1(з(н>.(ог(1(е fille признакин. Мясо-понтонный агар { МП.1.), Колонии мелк fcc, руглс и формы, сплof!1»H с, ровным краем, бледно->кс;ITîã0 цветя. Д:::::,fell> ко!0

H H11 7(3 . > c то (1(ой Hv, (HTv >1-.: — 1 - 1.О 3131. HO верхность гладкая, блсстящая, 00 слабой концентрической исчерченностью.

Посев штрихом ня МПА. У односуто (ной к3 льт3 ры рзст vмеренвь й. кр".é гладкий, блеск влажный,;кп1>ный, HGHcp>;HGGTh гладкая, не просвечивающаяся на свет.

Агаризовaííàÿ среда Хоттппге1>а. Пяти-семпсуто (няя культу1>я ппгзlептпрует среду прп

20 — 30" С.

Синтетическая минт мальняя среда. Рост отсутствует.

Синтетическая минимальная среда с добавлением адениня. Двухсуточная культура прп добавлении 0,2 — 0,5 мл11 аленина образует колонии диаметром 0,5 — 0,8 мм. Колонии сплошные, круглые. блестящие. с розным «ряем, Олсдно-желтого ц13стя.

Четырех-пятпсуточная культура при добавлcнин 0,2 — 0,5мли а (ен031IH-5-мо Iофосфорной кислоты обр азует отдельные колонн : 0,2 —0,3 мм.

При росте На мясо-понтонном бульоне в жидко(I синтет гчсско((миннмяльп(0(! срсде "Ie рез 24 ч. инкубацпи слабое помутнение, при аэрации помутнение сильное.

Картофель. Культура зеленовато-желтого цвета, пигмента не образ3 ет.

Биохимические свойства. Адениннедостаточный ауксотроф. Яелатину слабо раз>кп>кае .

КрЯхмал и кзетчатк Ile; свапl3аст. Молоко не пептоннзпрует. Н((гряты нс 13осстя((((ьл((гает.

Отношение к iòëåâîäàì. Глюкозу, фруктозу усвя1!вяет. Л акт Озу, гял яктоз3 не соря ж:113 яст.

Оптимальный рост lip„f 28 — -30=С. Выход 5 инозиновой кислоты — 6 — 8 г/11.