Способ выделения ферментов

Способ выделения ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (11) 516740

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 020373 (21) 1889378/13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет(43) Опубликовано 0506.76.Бюллетень № 21 (45) Дата опубликования описания 30.09.77 (51) М. Кл.

С 12 D 13/10

Гоеударетаонный комитет

Соната Мнннетров СССР но данам наобратаннй н открытнй (53) УДК577.15. 08 (088. 8) Б.А.Величко, К.A.Êàëóíÿíö, Т.П.Кузнецова и П.A. Станкевич (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЦЦЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ ИЗ

ЖИДКИХ РАСТВОРОВ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для выделения пектолитических, амилолитических, протеолитических и целлюлолитических ферментов, широко применяемых в биологии, медицине, а также в пищевой, комбикормовой и легкой промышленности, сельском хозяйстве и других областях науки и техники.

Известен способ выделения ферментов из жидких растворов, включающий вспенивание раствора путем пропуска через него воздуха.

Недостатком известного способа яв- 15 ляется: сложность процесса выделения ферментов, заключающаяся в длительной технологической схеме образования, отделения и очистки осадка, состоящего из фермента и сульфата аммония; а 20 также низкий выход ферментов за счет потерь ферментов, переходящих в пену, которая образуется при растворении сульфата аммония и в дальнейшем не используется; и за счет неполного оса-25 ждения ферментов.

С целью устранения указанного недостатка и увеличения выхода ферментов по предлагаемому способу перед вспениванием в раствор вводят сульфат 30 аммония, полученную смесь перемешивают, а пену собирают и концентрируют.

Целесообразно воздух на вспенивание подавать в количестве 0 05- 0,2 объема на объем смеси в 1 мин.

Предлагаемый способ выделения ферментов осуществляют следующим образом.

Микроорганизмы — продуценты ферментов культивируют глубинным илн поверхностным способом с последующим отделением биомассы микроорганизма от жидкой фазы.

Нативный раствор или экстракт концентрируют любым известным способом и при перемешивании растворяют сульфат аммония до насыщения, необходимого для получения фермента из жидкости при рН смеси, близком к изозлектрнческой точке выделяемого фермента. Полученную смесь одновременно перемешивают и барботируют воздухом в количестве 0,05

0,2 объема на объем смеси в 1мин.Образующуюся обильную пену собирают в отдельную емкость и концентрируют. Перемешивание и барботаж заканчивают с прекращением пенообразования, т.е. когда максимальное количество фермента из жидкости перешло в пену, сульфат аммония практически весь остается в растворе. Пену собирают и концентрируют.

516740

Жидкость, образующаяся при концентрации пены, представляет собой очищенный ферментный препарат, содержащий следы сульфата аммония (0,1-0,2Ъ).

Количество образовавшейся жидкости составляет 0,1-0,5 В от первоначально— го объема нативного раствора или экстракта.

П р е р 1. Культивирование микроорганизмов — продуцентов пектолитических ферментов осуществляют при оптимальных условиях в ферментере ем3 костью 65 м на питательной среде соответствующего состава. Для отделения биомассы глубинную культуру фильтруют, а ферментный раствор концентрируют.

Ферменты выделяют из концентрата путем добавления сульфата аммония до коэффициента насыщения 0,8 с таким расчетом, чтобы рН смеси был равен 4,5 (подкисление проводят 0,1 н Н РО.до

20 рН 2,5-3,0) . Смесь активно перемешивают. После полного растворения сульфата аммония смесь барботируют воздухом в количестве 0,1 объема на объем смеси в 1 мин.Образующуюся пену собира-25 ют и гасят силиконовым пеногасителем в количестве 0,001Ъ к объему собираемой воздушной суспензии /пены/. Перемешивание и барботаж заканчивают с прекращением пенообразования.После добав- 30 ления пеногасителя, пена гасится и образующаяся жидкость представляет собой высокоактивный очищенный концентрат пектолитических ферментов, из которого препарат выделяют методом ли- 35 офильной сушки.

С 1 м культуральной жидкости посЪ ле вакуум — концентрирования получают 100 л концентрата, а после осаждения сульфатом аммония, сбора и гаше- 40 ния пены-2,2 л ферментного раствора, высушенного на лиофильной сушилке.

Выход препарата по активности к вакуум-концентрату 97,8%.

Пример 2. Получение фермент- 45 ного раствора пектолитических ферментов осуществляют аналогично методу, описанному в примере 1. Ферменты выделяют из концентрата путем добавления сульфата аммония до коэффициента насыщения 0,8 с таким расчетом, чтобы рН смеси был равен 3,8 (подкисление проводят 0,1 н. Н>РО4 до рН 1,8-2,3) . Далее выделение ферментов ве дут аналогично способу, описанному в примере 1. Выход пектолитических ферментов в препарате по активности 95,2%.

Пример 3. Культивирование микроорганизмов-продуцентов амилолитических ферментов осуществляют при опти мальных условиях в ферментере емкостьюб0

50 м на питательной среде соответстз вующего состава. Ферментный раствор освобождают от биомассы и концентрируют. Амилаэу выделяют из концентрата путем добавления сульфата аммония при 65 нативном перемешивании до коэффициента насыщения 0,7 с таким расчетом,чтобы рН смеси был равен 5,9 (подкисление ферментного раствора проводят 0,1 н. НС2до рН 3,9-4,2). После растворения сульфата аммония смесь при перемешивании барботируют воздухом в количестве 0,1 объема на объем смеси в 1 мин. Образующуюся пену собирают и гасят механическим способом. Перемешивание и барботаж останавливают с прекращением пенообразования . После пеногашения из воздушной суспензии получают высококонцентрированный очищенный раствор амилазы. Из концентрата ферментный препарат выделяют лиофильной сушкой.

Выход амилазы по активности в препарате 95%.

Пример 4. Культивирование микроорганизмов — продуцентов щелочных и нейтральных протеолитических ферментов осуществляют при оптимальных условиях в ферментерах емкостью

50 м на питательной среде соответствующего состава.

Ферментный раствор освобождают от биомассы и концентрируют.

Ферменты выделяют из концентрата путем растворения сульфата аммония в концентрате до коэффициента насыщения

0,7 с таким расчетом, чтобы рН смеси был равен 6,5 (подкисление проводят

1 н.СН СООН до рН 4,5-5,0).Смесь интенсивно перемешивают и после растворения сульфата аммония барботируют воздухом в количестве 0,1 объема на объем смеси в 1 мин. Образующуюся пену собирают и гасят силиконовым пеногасителем в кодичестве 0,002% к объему собираемой воздушной суспензии. Перемешивание и барботаж заканчивают с прекращением пенообразования.После добавления пеногасителя из пены получают высококонцентрированный ферментный раствор, из которого выделяют препарат методом лиофильной сушки.

Выход протеолитических ферментов в препарате по активности 91%.

Пример 5 ° Культивирование микроорганизмов — продуцентов кислой протеазы осуществляют при оптимальных условиях в ферментере емкостью 65 м на среде соответствующего состава.

Глубинную культуру отделяют от биомассы и ферментный раствор концентрируют. Кислую протеазу выделяют иэ концентрата путем добавления сульфата аммония до коэффициента насыщения 0,8 с таким расчетом, чтобы рН смеси был равен 5,5 (ферментный концентрат подщелачивают 10% КН4ОН до ОН 3,0-3,8).

Смесь активно йеремешивают и после полного растворения сульфата аммония барботируют воздухом в количестве 0 15 объема на объем смеси в 1 мин.

516740

Формула изобретения

1.Способ выделения ферментов из жидких растворов, включающий вспенивание раствора путем пропуска через не— го воздуха, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода ферментов, перед вспениванием в раствор вводят сульфат аммония, полученную смесь перемешивают, а пену собирают и концентрируют

2.Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что> воздух подают на вспенивание в количестве 0,05-0,2 объема на объем смеси в 1 мин ° тель В.Величко

М.Левицкая Корректор,А.Власенко

Заказ 1626/138 Тираж 551- Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r.Óæãoðîä, ул.Проектная, 4

Образующуюся пену собирают и гасят силиконовым пеногасителем в количестве 0,0015% от объема собираемой пены.

Перемешивание и барботаж заканчивают с прекращением пенообразования

После добавления пеногасителя из пены образуется высококонцентрированный очищенный ферментный раствор, из которого препарат выделяют методом лиофильной сушки.

Выход кислой протеазы по активности в препарате 96%.

Пример6. Культивирование микроорганизмов-продуцентов целлюлолитических ферментов осуществляют в ферментере емкостью 50 м при оптимальных ь условиях на питательной среде соответствующего состава.

Биомассу отделяют от культуральной жидкости и ферментный раствор концентрируют. Выделение целлюлаз проводят из концентрата путем добавления сульфата аммония до коэффициента насыщения

0,85 с таким расчетом,,чтобы рН смеси был равен 3,95 (подкисление проводят

0,25 н. НСР до рН 2,0-2,5) . Смесь ак- 26 тивно перемешивают и после полного растворения сульфата аммония барботируют воздухом из расчета 0,12 объема на объем смеси в 1 мин.Образующуюся пену гасят силиконовым пеногасителем 30 в количестве 0,001% к объему собираемой воздушной суспензии. Перемешивание и барботаж останавливают с прекращением пенообразования.После добавления пеногасителя из пены образуется высо- 35 коконцентрированный очищенный раствор, иэ которого ферментный препарат выделяют методом лиофильной сушки.

Выход целлюлолитических ферментов в препарате по активности 963. 40

Пример 7. Поверхностное культивирование микроорганизмов — продуцентов пектолитических ферментов-осуществляют на среде соответствующего состава при оптимальных условиях.Для получения ферментного раствора из культуры проводят экстракцию ферментов водопроводной водой. Выделение пектиназ осуществляют из сконцентрированного экстракта путем добавления к нему сульфата аммония до коэффициента насыщения 0,8 с таким расчетом, чтобы рН смеси был равен 4,5 (подкисление концентрата осуществляют 0,15 н,Н РОф смесь активно перемешивают и после полного растворения сульфата аммония барботируют воздухом из расСостави

Редактор Л.Гончарова Техред чета 0,05 объема на объем смеси в 1 мин.

Образующуюся пену собирают и -асят механическим способом. Перемешивание и барботаж заканчивают с прекращением пенообразования . После гашения пены получают высококонцентрированный очищенный ферментный раствор пектолитических ферментов, из которого препарат выделяют методом лиофильной сушки.

Выход пектолитических ферментов в препарате по активности 96%.

Пример 8. Получение ферментного раствора пектолитических ферментов осуществляют аналогично методу, описанному в примере 7. Выделение пектолитических ферментов проводят из концентрата путем добавления к нему сульфата аммония до коэффициента насыщения 0,8 с таким расчетом, чтобы рН смеси был равен 3,8 (подкисление проводят 0,15 н. Н РО4). Дальнейшее выделение пектолитических ферментов проводят по примеру 7.

Выход пектолитических ферментов в препарате по активности составляет

94,8%.

Таким образом, предлагаемый способ получения ферментов в очищенном виде позволяет упростить технологическую схему выделения ферментов путем исключения стадий осаждения фермента, отделения осадка и длительной очистки его от сульфата аммония диализом. Время выделения фермента из концентрата сокращается приблизительно в 5 раэ; кроме того, обеспечивается повышение выхода фермента за счет сокращения потерь при осаждении и очистке фермента от примесей.