Способ получения азотсодержащего антибиотика

Способ получения азотсодержащего антибиотика

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

{t )I517265

{61) Доиолинтельный к патенту (22) Заявлено 30.07,73 (21) 1954501/28-13

4 (23) Приоритет — (32) 31 07.72

ГвсударвтввнннМ нвмнтвт

6вввтв Мнннвтрвв СССР вв двлвм нзобрвтвннй н втнрытнй (3l) 276546 (33) СЩА (43) Опубликовано 05,06.76Бтоллетеиь № 21 (45) Дата опубликования описания 16.09.7 (Я) УЙК 615.779.9 (088.8) Иностранцы

Роберт Л. Хамили и Вильям Макс Старк (США) (72) Авторы изобретении

Иностранная фирма

Зли Лилли энд Компани (США) (7)) заявитель (54) СПОСОБ ПОХ1УЧЕНИЯ АЗОТСОПЕРЖАШЕГО

АНТИБИОТИКА эрганическ;1х растгэрптелей и плохо рас-.aoIряется в всде.

П1ри подкожно;. введении мышам антиi биотик обнаруживает антимикробное дейстВНе 1л 1чьо. против экспериментальных бактррчяльных нф1 ций

Антибиотик способен тормозить или ин г11бирэваь рост м1,к оорганизмов, вызыва юших развитие заболеваний зубов.

1О При добавлении 45,4 r янтпбиотика на, 1 т корма средний прирост цыплят через

10 дней составляет 159 г (средний при» рост у контрольных животных 148 г).

М орфология, 35

Гифы ня синтетической или пэлусинтети» ческэй агаровэй среде сначала короткие. слабо разветвленные, септированные, диаметром 0,2-1,2 мкм, Через две недели колонии могут состоять, из четко выра, женных масс верт11кальных гиф, Ртхэдя1цих

;: от более глубоко погруженных в ягбрэвой р сред . 1 ифф или эни MD1"fT состоять 1!з сля» бо слизистой массы коротких гиф, затем; нятэших вертикальные гифы. В колониях с

Изобретение относится к фармацевтиче ской промышленности, а именно к новому способу получения язотсодержа1цего анти биотика.

Предлагаемый способ получения азотсо держа1цегэ антибиотика зяктпочается и том, что кул.::. : py ЛЮтторбц11я -"1Ыу1ет1ь ARRL ,5462 (,Д.,;1„) выраптивают ня среде,,содержя1цей ы:точннки углерэдя, азота и

IèåDðãâHè÷eñêèå соли, и выделяют целевой BpG T известными прием ам и, Полученный антибиотик представляет со бой белое аморфное твердое вещество, . 27,о

Щ = 132 (с 0,375, метанол).

Найдено, %: С 61 51; Н 7,51;;ф 8,69;

С 21,53.

С Н А О . (мол. вес 5032638).

УФ-спектр (95"/о-ный этанэл): А макс

214 ммк, Р 799.

")

Антибиотик растворяется в MBTB поле,,атанэпе, высших спиртах v. большиHcTBe (51) Кл. С 12 0 9/14

517265 13 четко выраженной массой вертикальных гиф мицелий образует компактный слабо пэднимаюшийся жесткий (кожеподобный) рост. В колониях с кэрЬткими гифами мицелий образует куполоподэбный рост. Воздушные гифы не образуются ни в какой среде. На поверхности куполообразных ко =, лоний образуется большое количество спорангий, Спорангии Образуются в избытке на по» еО лусинтетическом агаре Анно---Генссена, Они появляются через 2=- недеепе инкубации при 17-19оС. СпэраеегH!i находится этдель=но на очень коротких спорангиофэрах. Спо ра нгий м ожет иметь сферическую, субсфери- 1Ь ческую или слегка лопастную форму, сравни тельно невелик, диаметром 4-10 мкм, Спо рангий содержит 20 RO субс<рерических спорангиоспор, расположенных. в виде одного или нескольких витков з снэраев-ии. Спораее-- 20 гиоспоры имеют примерно 1 мкм в диаметре в зрелом состоянии.. астрескивание сцоран гия означает полную иене частичную де1 зинтеграцию спорангия. Е --.ерез 10-15 мин

Ъ после помещении в. воду спэрангий начинает набухать, приобретая типичную сферическую форму, и затем выделяет споры при дезин- . теграции стенок.

Внешн вид на QеB е, Агаровая среда Чапека, Хороший рост. В точке еенэкулядии обра;з, ется колэния диаметром 0,,75 см за 4 недели. Воздушных гиф peT. олэция обычно плоск а я с неб оль ши м це нт ра ль ным пик о м. живет колонии умеренно эранжевьей. Споран» З5 гии наблюдаются лишь в редких случаях.

Пептоно-агаровая среда Чапека.

Хороший рост. В точке инокуляции эб разуется колония диаметром около 1,0 см 4ее за 4 недели. Отсутствие воздушных гиф.

Колония слабо растет и несколько свертывается или, становится шишкообразной.

Ывет колонии от красновато-бурого дэ ко-! ричневэ оранжевого. Спэрангии не образу- 45 еэтся»

Агар Лнио-Генссена.

Отличный рост. В точке инокуляции об- . разуегся колония диаметром 0,5 см за д)

4 недели. Отсутствуют воздушные гифы.

Колония имеет круглую, крестообразную или звездообразную форму с понижением или расселиной в центре. Спорангии образуются в большом количестве в колониях, инкубиро-Я о ванных при 17-19 С, в небольшом количестве в колониях, инкубирэванных при более высоких температурах.

Продуцент антибиотика Щ(едср ддр . .1

Е хранится в коллекции культур сельскохоэяй 69

4 ственной научно-исследовательской службы, Ф

Северное отделение изучения питательных веществ, департамента сельского хозяйства, США Пеория, Иллинойс 61604, за номером

48k/. 5462.

Культуральная среда, на которой вырашивают культуру Л. fiick.., содержит глюкозу (источник углерода), соевую муку (источник аЬота) и неорганические соли, содержашие ионы натрия, калия, аммония, кальция, фосфат-, хлорид», сульфат» и ацетат-ионы). Для получения лучших результатов в культуральную среду вносят дрожжевые экстракты.

РН культуральной среды 6,5-7,3.

Для продуцирования антибиотика в боль ших количествах используют глубинную аэробную ферментацию в больших танках.

Небольшие количества антибиотика получают в матрицах-каналках. Вегетативный инокулум получают инокуляцией небольшогэ: объема культуральной среды спорами или фрагменгами мицелия, полученную свежую активно растущую культуру микроорганизма (вегетативный инокулум) переносят в большой танк. Среда, используемая для выра» шивания вегетативного инокулума, может быть такой же, как и для вырашивания антибиотика в больших количествах.

Продуцент антибиотика можно ве,пвшивать при 20-40 С, предпочтительно при

30 С, При аэробнэй глубинной ферментации стерилизованный воздух пропускают или продувают через культуральную среду. Для, роста микроорганизмов и продуцирования антибиотика подают в танк 0,1 объема воздуха в 1 мин на 1 объем культуральной среды.

Максимальное продуцирование антибиотика наблюдается в течение 2-6 дней в большом танке или колбе-качалке.

Антибиотик извлекают иэ культуральной среды и отделяют от других присутствующих веществ методом экстракции или адсорбцееее. В качестве экстрагента используют хлороформ, который хорошо растворяет антибиотик, выделяемый иэ подшелоченной культуральнэй среды, Для дальнейшей очистки антибиотик хроматографируют, например, на угле, полиамидной смоле, силикагеле, сефадексе Н20, амберлите Хду

Пример „1. Ферментация антибиотика в колбе-качалке.

Приготовленную культуру А. (е!. NRRL

5462 выдерииваеэт на косом агаре следуюшего состава:

517265

1

Стерилизованиная сухая овсяная мука, г

Сухие пивные дрожжи (беэ горечи), г

Гидрофосфат калия

К НРО

Минеральная среда

Чапека, мл

Агар, мл

2,5

1,0

5,0

1100

Минеральная среда Чапека состоит из

; 2 г сульфата железа i е 04 ° 7Н2

° 7Н О .(раствор в 2 мл коннентрированной соляной кислоты), 100 r хлорила калия КС1,. (.100 г сульфата магния Мр оО УН 0 ,и до 1 л обессоленной воды. К среде

;(рН 6,2) добавляют едкий натр до рН 7,3 и стерилиэуют в, автоклаве 30 мин при . 120 С (pH 6,7).

Косой агар инокулируют А. ;/ фЯД .

5462 и инкубируют 10-14 дней при 30 С. В указанной среде культура обычно, i не образует спор. Поэтому необходимо пленку мицелия промацерировать плоской заИ остренной инокулируюшей иглой для увели

;чения числа потенциальных центров роста.

Мацерированную зрелую культуру покрывают бычьей сывороткой и аккуратно царапают.

;<0 стерильным стержнем для получения мицелиальной суспензии, которую переносят в ,6 пробирок для лиофилизации, Лиофилиэат из какой-нибудь пробирки используют для инокуляции 50 мл вегетативной среды, со

35 держащей (г);

Глюкоза

Картофельный крахмал

Соевая мука

Обезжиренная мука из семени хлопчатника

Карбонат кальция

Вода, л

20 2

1,1

Инокулированную . вегетативную среду .в колбе на 250 мл инкубируют 72 час при

30 С на ротационной качалке (250 об/мин) . отбирают 10 мл инкубированной вегетатив ной среды и инокулируют 200 мл.вегетатив,ной среды второй стадии, Среду (второй стадии) в колбе на 1 л инкубируют 24 час ,при 30 С на ротационной качалке (250 об/мин) .

Пример 2; Ферментация антибиоти:ка в танке.

200 мл. полученной вегетативной среды, второй стадии (см. пример 1) используют, для инокулирования 25 л стерильной про дуцентной среды, содержащей (70): а

1.0

4,0

0,5

Глюкоза

Картофельный крахмал

Меласса

Растворимый мясной п ептон

Казеин, гидролиэованный ферментативно

Соевая мука

Сульфат магния

Карбонат кальция

Антивспениватель

Вода л

4,0

0,4

1,0

0,3

0,2

0,02

До 25

Н реды после стерилизации в автокла4. ве при 120 С в течение 30 мин равен 6, Инокулированнук среду оставляют в ферментере емкостью 40 л на 4 чня при 30

00С, Ферментационную среду аэрируют стерили зованным воздухом иэ расчета 0,5 об1,ема вают, сушат в вакууме и получают 3,13 г неочищенного антибиотика.

Неочищенный антибиотик расгворяют в

100 мл этилацетата, пропускают через колонку с основным глиноземом, промывают колонку 300 мл этилацетата, элюируют ,смесью этилацетат - этанол (19:1), фрак« ции, содержашие антибиотик,объединяют,,упаривают. досуха в вакууме, растворяют остаток в небольшом количестве хлороформа, приливают к 20 обьемам петролеиного эфи .ра, отфильтровывают осадок, сушат в вакуу-! ме и получают 1,63 r антибиотика.

Пример 4, Проводят onbn, как в

;примере 3, осаждают антибиотик петролей.ным эфиром, 5 r выделенного продукта растворяют в 10 мл этилацетата и доста« точном количестве метанола, чгобы полу чить прозрачный раствор, пропускают раст вор через колонку с 300 г силикагеля в этилацетате, промывают колонку 2,5 л этнлацетата до удаления примесей и элюируют антибиотик смесью этилацетат - эта,нол (95;5). Активные фракции объединяют, упаривают досуха в вакууме и получают

: 2 r белого порошкообраэного антибиотика.

)При дальнейшем элюироваиии дополнитель воздуха на 1 объем культуральной среды в 1 мин. Ферментационную среду перемешивают обычной мешалкой (400 об/мин).

Пример 3. Выделение антибиотика.

Всю ферментационную жидкость (бульон) из танка емкостью 25 л отфильтровывают, .добавляют к фильтрату 2 н. едкий натр до рН 8,5, экстрагируют 2/3 объеме хлороформа, упаривают экстракт в вакууме до небольшого объема и медленно при переме шивании приливают;к 20 объемам петролейного эфира. Выпавший осадок отфильтровы517268

Составитель С щ алютина

Редактор 1,111аргаиова екред 3, 1 араненко корр >.11.Котова

Заказ 5?77 Изд. И g7 Торнес ф Подписное

1111ИИ11И Государственного комитета Совета Министров СССР во делам изобретений и открытий

Москва, 113035, Раушская наб., 4

Филиал ППП Патент, r, Ужгород, ул. Проектная, 4 с7 но выделяют 0,8 мг антибиотика в виде светло-желтого порой ка. чр о р м у л & м э о б p e т е н и я . Способ получения аоотсодержащего антибиотика, отличающийся тем, что кулътуру АсЬиф1анеа рйрр енз з NRRL1.ô462 выращивают йа среде, содержащей ,источники углеродар азота,и неорганические >ogtt и выделяют целевой йраодукт иэвест1 Яымм приемами.