Способ выращивания вируса ящура

Способ выращивания вируса ящура

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН Ия в.ок>з Сове смих

Социалистимескии

Республик (11)1 5 1 9138 (6!) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 31.01.73 (2l) 1882920/30-15 (51) М. Кл. С 12 К 1/00 (23) Приоритет (32) 12,02.7.2 (31) Р .2206779,4 (33) ФРГ (43) Опубликовано 25.06,76.Бюллетень № 23 (45) Дата опубликования описания 01,09.76

Гаеударствеиный комитет

Совета Министров СССР

w делам изобретений и аткрытий (53) УДК 619:576..858 .6 16.988,43 (088.8} (72) Автор изобретения

Ино стран ец

Хорст-Ульрих Ранеберг (ФРГ) Иностранная фирма

"Байер АГ" (ФРГ) (7! ) Заявитель (54) СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИИ ВИРУСА

ЯЩУРА

Изобретение относится к ветеринарии.

Известны способы выращивания вируса ящура, включающие его культивирование на суспензии переживающих клеток слизистой желудка жвачных, преимущественно крупно- 5

ro рогатого скота, с последующйм вьщелением, С целью повышения выхода целевого продукта культивирование вируса проводят на указанной суспензия, смешанной с суспен- и зией переживающих клеток эпителия языка крупного рогатого скота.

Для осуществления способа используют слизистую оболочку языка крупного рогатого скота и желудок жвачных животных, преиму- и щественно желудок крупного рогатого скота, а именно превратниковую часть и дно рубца.

Языки крупного рогатого скота обрабатывают ho методу Френкеля, слизистую оболочку языка изолируют и собирают в изотонический, содержащий антибиотик, ледяной раствор соли. Непосредственно после извлечения желудка отделяют превратниковую часть и свободную от ворсинок часть дна рубца. Эти части промывают теплой водой, отделяют жировой слой, облучают каждую сторону в течение 2 минут ультрафиолетовым светом на расстоянии 30 см и складывают в содер жащий антибиотик изотонический охлажденный льдом солевой раствор.

Полученные по методу Френкеля эпитэлиальные клетки языка рогатого скота и иэо» лированные как описано выше части рубца размельчают в мясорубке (величина отверстий 12-20 мм) и трижды промывают изотоническим холодным солевым раствором.

Затем раэмельченные ткани рубца и размель-ченные эпителии языка встряхивают в течение 1 час в содержащем антибиотики иэотоническом солевом растворе следующего состава (x ): Ма С 8, КСЕ 0,4, ИаНСО 0,35 пенициллин 0,5, хлорамфеникол 0,25, нистатин 0,075, а также 1000 мл дистиллированной воды.

Полученный остаток декантируют, и тканевую массу инфицяруют 1/10 общего объема исходной смеси суспенэии вируса ящура.

После адсорбции в течение 20 мин инфи- цированные ткани рубца и эпитэлиальные клетки языка при стерильных условиях поме —.

519138 шают в приготовленный для купьтивироваишя, ( вирусов ферментер, содержашии необходимую пропорцию питательной среды.

В качестве питательыэй среды используют физиологический раствэр с рН 7,4-7,6 следующего состава, r: NaQ 720, К И 18, СаО 6Ц0 18, Ng (,1 6H@0g NzN@30g Я 0

11,1, Йа.НС0 200, Иа, „НР0 БН О48,06, глюкоза 100 пептэн 240, касайнгидрэли-, зат 300, Ш вЂ” метионин 12,8, Н1 — трипто- фан 8,0, Ij t — треонин 2,5,t. - цистин НИ

5,2, Е -- тироксин 0,0009Л"Са пантотенат

0,ОЗ2, ниацин 0,16, хлэрамфеникол 10, пеницилин 32, неомицин- сульфат 10, полимиксин В 0,5,; нистатин 0,75.

Кроме того, среда сэдержит 0,02%-ный растер гемина 3,6 мл, инсулина 80 З и

100 л дистиллирэванной воды.

Исходную смесь для выращивания после добавления суспензии ткани с вирусами устанавлива1от при помощи гликокол-буфера на значение рН 7,4-7,6 и размешивают при

37 С и с 25 об/мин, Гликокол-буфер имеет следующий свстав, г: гликокэл 158, ЙаС 1-4,ИаОН Gl";I, а также дистиллирэваннэй воды 1000, мл.

Одновременно в исходную смесь ввэдят для выращивания стерильно отфильтрэванный чистый кислорэд (2 м/мин). Значение рН исхэдной смеси непрерывно контролируют и, еслч необходимо, регулируют добавляя гли- кэкэл-буфер на значение рН 7,4-7,6.

Через 18-24 час, в зависимости от типа вируса, прекращают выращивание вируса и охлаждают суспензию до 4 С. Затем содержащие вир ткани (ткани рубца и эпителиальные клетки языка) размельчают при помощи коллэидной мельницы, чтобы пэлучить находяши ";. a клетках вирусы. Вскрытую таким образом тканевую массу вместе с содержащей вирусы средой для выращивания экстрагируют, медленно размешивая (3 5 эб/мин), в течение 1 час при 4 С. В суспензию тканы добавляют мертоган (Тимерэзал), с коыентрацией 1:40000 или 0,2 -1

1% жлэрофэрма.

1ьэсле экстракции суспензию вирус в цен-, трифугируют в непрерывно действующей цен- трифуге., Полученный таким образэм прозрачный экстрат вирусов после количественного отделения его янтигенного содержания вирусов, ящура мэжет бы.ь примейен как антиген для, :4 1 изготовления вакцины против яшура, Определение содержания вируса, а именно содержание инфекциозных антиген и комплементо.-связывающих антиген, происходит кэ- личественнэ.

Содержание ичфекционного антигена определяют на мышах следующим образом.

Каждые 10 мышей B вэзрасте 4 — 7 дней получают пэд эфирным наркозэм 0,10 мл разжижения вирусов 10 10, 10, 10

Э ° -9

1 -0, i 0 внутрибрюшную инъекцию. Опыт продолжается 7 дней. Смертные случаи до истечения 48 час после инфекции не принимаются во внимание, так как инкубационный период продэлжается 48 час.

Содержание кэмплементо-с:вязываюших

IO антиген определяют количественнэ серолэгически в реакции связывания кэмплемента при помощи спектрофотометрического анализа, Пример 1.

15 кг ткани рубца и 15 к эпителиальIS ных клетэк языка, очищенных облучением ультрафиолетовых лучей, собирают в изотонический, содержащий антибиотик, солевой раствор и размельчают в мясорубке.

Полученную таким образэм тканевую массу промывают физиологическим раствором и затем встряхивают в течение 1 час с изэтвническим, содержащим антибиотик, солевым раствором. Затем солевэй раствэр отделпот декантированием и тканевую массу инфицируют 30 кг суспензии вируса яшура, южно-американскогэ типа вируса С, титр вируса которого сэставляет N@LD 10 Х х g

Пэсле адсорбции в течение 20 мин инфицированную тканевую массу в стерильных условиях помещают в ферментер, наполненный 240 кг питательнэй среды. Питательо ную среду перед тем нагревают дэ 37 С.

Исходную смесь для выращивания при помощи 250 мл гликокол--буфера устанавлйвают о" йб на значение рН 7,5 и размеыивают при 37 С и с 25 об/мин. В течение всего процесса выращивания в тканевую суспензию пропускают стерильно фильтрованный чистый кислэрсд (2 л/мин). Значение рН постояннэ кон40 тролируют: через 5 час и через 8 час пэсле инфицирэвания, устанавливают дэполнительнэ, добавляя пэ 300 мл, а через 14 час после инфицирэвания, дэбавляя 400 мл гликокол-буфера на значение рН 7,4.

После 12 час инфиш рования (с прэмежутком в 2 час) до 22 час после инфицирэ вания отбирают пробы для кэличественног0 определения содержания инфекциозных и комй@ плементо-связывающих антигенов. Выращи 7

-ванне прекращают через 22 час, и исхэдную смесь охлаждают до 4 С. Части ткани исходнэй смеси для вырашиьания при помощи коллоидной мельницы открывают для конечнэй экстракции вируса.

Обработанную таким образэм тканевую массу вместе с содержащей вирус средой для выращивания экстрагируют в течение о

1 час при 4 С, медленно размешивая /35 об/мин/.

519138

Таблица 1

Т а бли ца 2

Пэсле экстракции суспензию вирусов центрифугируют .в непрестанно действующей центрифуге. В пэлученную таким образом прозрачную суспензию вируса добавляют мертагон в концентрации 1: 40000.

Титр вируса и титр кэмплементэ-связывающего антигена развиваются в течение

22 час прэцесса /табл.1/.

Пример 2. Согласнэ примеру 1 из эпителиальных клеток языка крупного рогато-® го скота и ткани рубца получают суспензию и инфицируют ее южнэ-американским вирусом яшура типа О, пэдтип 01 — Ca,ìó (òèòð вируса Nd.9,о= 10 /мл).

Вырашивание вируса прекращают после

; 20час. Развитие титра вируса и титра ком,плементо-связывающего антигена проходит следуюшчм образом (табл, 2).

Пример 3. Согласно примеру 1 из ткан.. рубца и эпителиальных клеток языка крупного рогатого скота изготовляют суспен6 зию ткани и инфицируют южнэ- -американским

:вирусом типа А подтип А (титр, вируса"

H@LD 10 6n), Через 24 час выращивание прекращают и собирают вирус. Развитие титра вируса и титра кэмплементэ-связывающего антиге на проходит следующим образом, (табл. 3).

Полученные пэ примерам 1, 2, 3 суспензии вируса применяют в качестве антигена

;вируса яшура трехвалентнэй вакцине про;тын яшура.

Вакцина зашишает рогатый скот против .искусственного заражения примененными для ,ее изготОвления тремя типами вируса 0

Самую А и С.

Предлагаемый способ позволяет исполь зовать в качестве вируса яшура, например, еврэпейские О, А и С, южно-американские

О, А и С, африканские )AT 1,2 и 3, а также .азиатские типы, например AgjQ 1, и все пэд:.типы названных оснэвных типэв вируса.

510138

Табл нц» 3

Составитель Е. Арская

Редактор Д. Пинчук Техрвд М. Ликович Корректор 5. Югас.

Заказ 2387/236 Тираж 55 1 Пэдписнэе

11НИИП! Государственногэ комитета Сэвета Министров СССР пэ делам изобретений и открытий

113035, Мэсква, Ж-35, Раушская на6, д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгэрод, ул. Проектная, 4

Формула изобретени я

Спэсоб вырашивания вируса яшура, вклю чаюший его культивирование на суспензии переживаюших клетэк слизистой желудка жвачных преимущественно крупнэго рогатого скэта с последуюшим выделением, D т л и-. чаю щи йс я тем, что, сцельюповышения выхода целевого продукта, культивирование вируса проводят на указанной суспензии, смешанной с суспензией переживаюших клеток апителия языка крупного рогатого скота.