Способ получения литических ферментов

Способ получения литических ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советскик

Социалистических

Республик

О П И С А Н И E «)5!9470

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. сзпд-ву— (22) Заявлено 28.09.73 (21) 1962088/13 с присоединением заявки— (23) Приоритет— (43) Опубликовано 30.06.76. Бюллетень № 24 (45) Дата опубликования опнсання 06.09.76 (51) М.Кл. С 12 D 13/10

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений, и OTKpbITNN (53) УДК 577 15.08 (088.8) (72) Авторы изобретения

Л. Н. Шинкаренко, Ю. С. Бабенко и Е. Ф. Григорьев

Днепропетровский ордена Трудового Красного Знамени государственный университет имени 300-летия воссоединения Украины с Россией (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

10,0

0,5

Соевая мука

Глюкоза

Азотнокислый калий

Двузамещенный фосфорнокислый калий

0,1

Изобретение относится к микробиологической .промышленности, точнее к способу получения литических ферментов.

Известен способ получения литических ферментов путем культи вирования актиномицетов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и индуктор, с последующим выделением фермента из среды культивирования, например, осаждением сульфатом аммония.

Предлагаемый способ позволяет получить высокоактивные ферменты широкого спектра действия при незначительных затратах на его получение.

Достигается это тем, что из актиномицетов используют актиномицеты, относящиеся к виду recifensis. При этом из актиномицетов вида recifensis используют штамм var. lyticus

2435, а .в качестве индуктора синтеза фермента используют микроорганизмы вида Staphylococcus aureus, в частности штамм 142а.

Культивирование продуцента ферментов осуществляют на среде, где в качестве источника углерода и азота используют соответственно глюкозу и соевую муку, а из минеральных солей — азотнокислый калий и двузамещенный фосфорнокислый калий. При этом указанные компоненты вводят в следующих количествах, г/А:

Вйделение фермента из среды культивирования целесообразно осуществлять сульфатом аммония при насыщении его до 40%.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что в качестве инокулята используют блоки семисуточной культуры продуцента, выращенного на твердой среде Чапека. Выращивание продуцента ведут в усло15 виях глубинного культивирования при активной аэрации при 28 — 30 С в течение 2 — 3 суток.

Ферменты накапливаются в культуральной жидкости, которая после удаления мицелия и неиопользованHûõ остатков соевой мужи служит для получения фермента.

Очищенный ферментный препарат получают высаливанием при 0,4% насыщения куль25 туральной жидкости (NH4) $04. Полученная таким способом фракция белка практически свободна от примеси протеолитических и амилолитических ферментов. Белковый осадок

:промывают в ацетоне, .подсушивают, раснвоЗО ряют в буферной системе, подвергают диали51 94 0 зу против растворителя. Диализат высушивают,при 0 под вакуумом. Получаемые таким способом литические ферменты характеризуются устойчивостью в широком диапазоне рН среды: 4,5 — 9,5 (оптимум 7 — 8), активны при 25 — 40 С (оптимум

37 С). Длительно сохраняют активность при

+4 С и при нагревании до 60 С (в течение

30 мин).

Используемый штамм Actinomyces гес11еп- 10

sis x ar. lyticus 2435 выделен из суглинистой почвы Днепропетровского ботанического сада путем культивирования на селективной среде, содержащей клетки Яар4у!ососспз аигепз

142а в качестве единствен toro источника 15 углepод>гого и азотного питаu ия, и и !eeт следующую характеристику.

Морфология.

Диаметр воздушного мицелия 0,7 — 0,9 мк.

Спороносцы короткие, неспиральные, почти 20 прямые, у,молодой культуры чуть волнистые, ;расположены скученно, метелкой. Споры овальные, оболочка гладкая. Воздушный мицелий серо-зеленоватый, окрашиваются колонии, но не среды. 25

Окраска субстратного мицелия более интенсивная, чем у воздушного.

Культуральные признаки.

Среда Чапека: рост обильный, колонии сероватые, поверхность бархатистая. 30

Крахмально-аммиачная среда: рост хороший, колонии зеленовато-серые " желтоватым оттенком.

Среда Гаузе 1 с минеральным источником азота: рост хороший, колонии бархатистые, 35 воздушный мицелий серо-зеленый, субстратный — серо-коричневый.

Среда Гаузе Il с органическим источником азота: рост xoðoøtté, воздушный мицелий серо-зеленый, суб-"тратный — красно-коричне- 40 вый. Бурое вещестзо не образуется.

МПЛ. Дрожхксвой агар с мальтозой: рост обильный, колонии буро-зеленоватые. Воздушный мицелий ceðî-желтоватый.

Полусиптетическая среда для глубинного 45 культивирования продуцента, обеспечивающая высокий выход литического комплекса: соевая;t:,"ка — 1 0 a/a, К." Оз — О, о г л, r t to oза — 5 г/л, К НРО.,— 0.1 г, клетки индуктора

Staoh. aureus 142а. 50

Мицелий на данной среде образуется,в виде спутанных клубков нитей с небольшим коли .сстзом разветвлений.

Физиологические свойства.

5Келат па разжижается быстро, молоко ,пептонпзируется. Крах., ал гидролпзует-.я относительно слабо. Нитраты восстана вливаются, тирозиназа не образуется. На клетчатке рост есть. Хорошо усваиваются практиче-. ски все сахара, но их присутствие в среде в зна нтельных,количествах снижает синтез литических ферментов. Растет в пределах 14—

45 С (оптпмум 28 С) . Синтез литических ферментов t..trèáèðyåãñÿ Zn+ —, Cu+, Мп++, Fe++; активируется Ca++, Mg++.

Продукция ферментов возможна в диапазоне рН среды от 4,5 до 9,5; оптимум 6,0 и 9,0.

Слабь|й антагонист. Незначительно подавляет рост отдельных грамположительных бактерий и дрожжей, совершенно не угнетает грамотрицательные формьь Продуцируемые ферменты глубоко лизируют клетки организмов, относящихся к родам Staphylococcus, Diplococcus, ticrococcus, Bacillus, Escherichiae, Salmonellae, Vibrio

Corynebactet Saccharomyces, Shizosaccharcmyces, Candida.

С помощью данного штамма возможно осуществлять Halnравленный синтез, т. е. получать ферменты, обладающие определенными заранее заданными литическими свойствами, благодаря введению в среду требуемого индуктора.

Способ поясняется следующими примерами.

iH р и м е р 1. Среду Л 6, содержащую в

1 л дистиллированной воды 0,1 г К НРО», 0,5 г KNO3, 5 г глюкозы и 10 г соевой муки, засевают культурой продуцента блоками 7—

10 суточного штамма Actinomyces recifensis

var. lyticus 2435, выросшего на твердой среде

Чапека. B среду одновременно с,посевным материалом вносят клетки индуктора — проавтоклавированную взвесь $1ар1ту1оcîññus

aureus 142а, содержащую 15 108 кл/м г.

Взве ь добавляют в количестве 0,1 мл на 1 мл среды.

Культивирование велось при активной аэоации и перемешивании среды,при 27 — 28 С в течение 3 суток.

После окончания инкубации культуральную жидкость освобождают от;tицелия и неиспользованных остатков питательной среды дентрифугированием при 6000 об/мин в течение 15 — 20 мин.

Прозрачную культуральную жидкость, содержащую сырой литический,фермент, насыщают до 0,4 сернистым аммонием; полученный солевой раствор оставляют при 4 С на

16 — 18 час для формирования осадка. Осадок .,ыпавшего. белка собирают фильтрованием .-.oä вакуумом (лри пониженной темгературе), прамывают холодным ацетоном, подсушивают до удаления ацетона и растворяют в аце .атном буфере рН 5,5 (0,1М), взятом в количестве 0,1 от исходного объема культуральной жидкости. Нерастворимый осадок отделяют в . ечение 10 мин центрифугированием при

5000 об/мин.

В полученном растворе белка определяют литическую активность.

К 2 мл взвеси живых клеток Staphylococсиз aureus добавляют 1 мл ферментного раствора белка. На ФЭК-М при желтом светофильтре измеряют исходную плотность суспензии (не должна превышать 2), затем взвесь термостатируют при 37 С в течение

35 час и снова из меряют плотность раствора.

Эффективность лизиса определяют по глуби519470 не лизиса исходной взвеси за 3,5 час, т. е. по соотношению плотностей в исходном и конечном растворе, выраженном в процентах.

Табл:u!a 1

Плотность 1 Глуконечного 1 бина раствора 1 дизи(ОД) са,,4

1Время Плотность реак- исходного ции, раствора сас I (ОД) Л изируегяая культура

0,25

83,0

1,5 лживые клетки, 3,5

Staph. aiireus

Литическую активность данного ферментного раствора аналогичным образом исследуют и в отношении ряда других микроорганизмов, Таблица 2

Г чуб!и!а лизиса !(i!

Лнзируе(чые культуры мертвые клетки

1 .к, a;! e клетки

1 1ОО,О 100,0

107,0 106,0

Staph пзгеиз

Р(р(ососсцз sp.

Cor!inebact. diphteriac

Бас. subtilis SH gw

Яа!гпonella gall:апаг;:m

Вас. subtilis (S. форма)

Вас. mccoiiles

103 97 О

96,5 61,4

93,2 I 16,7

901 О. (81.0 1 80.0

Е. coli

76,6

МУсгococc s РУо чепез

Вас. megatec1ип1

Вгисепа bronchiseptica

М. )) sodeicticus

Вагс1па lutca

67,6, 2,3

66,0 16,0

65,5

12,3

420 1 25

) l 7.6, 6,!,Пример 2. К среде Л 6 в качестве индуктора добавляют прогретую взвесь клеток

Bacillus mycoides в количестве 0,1 мл на 1 мл среды.

Выращивание и обработку культуральной жидкости ведут, как указано в примере 1.

Литическую актив(!ость ферментного раствора белка проверяют з отношении живых и прогретых клеток Staphг! ococcus аь(ге((з и

Bacillus mycoides.

Результаты представлены в табл. 3, где гоказана зав (симость (в сравнении с данныРезультаты этих исследований представлe!11 в табл. 2. Глубина лизиса живых клеток

Staph. auIeus принята за 1 00% .

r мп табл. 2 примера 1) литической активности от природы индуктора.

Таблица 3

1 . Плотность Глуконечного, бина раствора, .1нзнОД 1са. О1о

Bpe!i!aj реакции, час

Плот (ость

ИСХОДНОГО раствора, ОД., зируеиая культура

Прогретые

1О

0,62

3,5

1. St aureus

0,59 5,0

2. Вac. mycoiiles

021 j 580

0.54 30,0

1 !

G,5

3,5

5Кивые клетки

3,5

0,78

1. St. aureus

2. Вас. mycoides

0,3 57,0

0,70

3,5

Та ким образом, применение в качестве индуктора Staph. aureus обеспечивает ш|ирокпй спектр литической активности ферментов. Вас.

mycoides 11(!зируется этим ферментом на 80% по отношению к стафилококку.

Испочьзование клеток других микроорганизмов в качестве индуктора,стимулирует синтез ферментов с целенаправленным спект30 ром действия.

Формула изобретения

1. Способ .получения литических ферментов путем культивирования актиномицетов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и индуктор, с последующим выделением фермента из среды, например, осаждением сульфатом аммония, отл ич а ющийся тем, что, с целью получения более активных ферментов и с более широким спектром действия, из актиномицетов используют актиномицет, относящийся к виду (ecife((sis.

3. Спосоо по пп. 1 — 2, отличающийся тем, что в качестве индуктора используют микросргaii. (змы, относящиеся к впду Яар((у-! ссОсс((я ацгепь.

4. СИОСОО по 11п. 1 — 3, Ст I и чаю щийс я те I, что .13 вида Staphylocoссцs aureus !спользуют штамм 142а.

5. Способ по пп, 1 — 4, отличающийся

—,åì, что з качестве источника углерода и азота в среде используют соответственно глюкоз г !(-"Сез (О у у, а (10 00 1 си aaoT .!Ciic

G5 лый калий и дзузамещенный фосфорнокис2. Способ по и. 1, о тл и ч а ю шийся тем, что из актиномицетов вида lecife(Isis использ ":.:T и! . а,(!I "аг Ivticus 435.

519470

Соевая мука 10

Глюкоза 5

Азотнокислый, калий 0,5

Составитель М. Ларина

Техред Т. Курилко

Редактор Е. Дайч

Корректор В. Гутман

Заказ 837/1070 Изд. № 1537 Тираж 575 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, 5К-35, Раушская наб., д. 4/5

Тип. Харьк. фил. пред, «Патент» лый калий,,при этом указанные компоненты введены в следующих (количествах, г, л:

Двузамещенный фосфор нокислый калий 0,1

6. Способ по пп. 1 — 5, отл ич а ющ и и ся тем, что,при выделении фермента из среды

5 сульфатом аммония, его вводят до 40 о насыщения.