Способ приготовления диагностических сывороток к вирусам растений

Способ приготовления диагностических сывороток к вирусам растений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

) 5I9472..

Союз Советских

Сокиалиотическкк

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

1

1 !

1

Ф

f !

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— .;22) Заявлено 03.03.75 (21) 2112142/15 (51)М.1хл.- "С 12 К 1/04 л, "// 5 69 с присоединением заявки ¹â€”

Государствеииыв комитет

Совета Министров СИР ао делам изобретений и откдб1тий (23) Приоритет— (43) Опубликовано 30.06.76. Бюллетень № 24 (45) Дата опубликования описания 06.09.76, 53) УД1х 632.07 (088.8) (72) Авторы изобретения

Ю. М. Яелудько и H. A. Погорилько (71) Заявитель

Украинский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии (54) СЛОСОВ ПPИГОТаЕЛЕНИЧ

ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СЫEQPOTOK

К ВИРУСАМ РАСТЕНИЙ

Изобретение относится к фитовирусологии, преимущественно к серодиагностике, широко применяемой при вирусных заболеваниях, в частности, в семеноводстве при,получении исходного безвирусного материала.

Известен способ .приготовления диагностической сыворотки к К-вирусу картофеля путем накопления антигена этого вируса в свойственных ему растениях-хозяевах и заключающийся в получении инфекционного сока после замораживания и измельчения листьев, низкоскоростного центрифугирования (15 мин при 9000 об/мин), эмульгирования с /, частью хлороформа в течение 20 мин, вторичного центрифугирования при том же режиме и ,внутривенного введения животным полученного антигена.

Однако существующий способ приготовления диагностических сывороток не .позволяет получить высо!кокачественные сыворотки изза невозможности биологической очистки вируса растений и из-за агрега!ции вируса.

Целью изобретения является повышение качества диагностических сьгвороток к,вирусам растений.

Для этого по предлагаемому способу в .качест!ве растений-накопителей используют серологически неродственные тем, на которых проводят серологические анализы (например, для Х-вируса картофеля — дурман, для М- л Sв.;1руcов картофеля — томать! сорта Советскпш и Невский соответственно). Путем накопления вирусов в серологически неродственных растениях достигается биологическая очистка

ВируcoB от coIIYTcTB þ1öèõ а11т;1ге!!Ов.

Для стабилизации вирусов и предотвра-. щения их агрегации экстрагирование проводят в специально подобранном рабочем буфере, содержащем 0,05М цнтрат:1атрня (трехзамещенный лимонно-кислый натр;1й), 0,007М трилон Б (динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) и 0,2о1о-ный сульфит натрия.

Для ocBeT:IåII;";ÿ 11нфекц11о:11Ioro сок» эмульгирование с охлажденным хлороформом

1проводят 3 — 8 мин.

Зкстрагирование вируса в рабочем буфере и кратковременное эмульгирование обеспечивают сохранение неустойчивых вирусов в неагрегированном состоянии. Очистку вирусов от компонентов клетки растений-накопителей проводят методом гельфильтрации на комбинированных хром атографических колонках, заполненных гранулированными ге25 лями на декстрановой основе. Путем гельфильтрации освобождают вирус от большинства сопутствующих веществ, содержащихся ,в инфекционном соке, в том числе от растительных белков, коричневых и зеленых пигментов.

5Кивотнь{х иммунизкруют .путем введения очищечного и концентрированного вирусного антигена комбинированным способом (внутримышечный и внутривенный) с адъювантами и последующими реиммунизациями только внутривеннь{м способом. Комбинированная иммунизация значительно повышает иммуногенность организма, титр диагностических сывороток, и, следовательно, их качество. (П.p и м.е р 1. Для получения высококачеСТВЕН{{Ъ|Х ДИЯГНОС РИ({ЕСКИХ СЬ{ЗОРОТО .l iк тр: vt вирусам картофеля их размножают в серологически неродственных картофелю растениях (Х-(вирус — в дурмане, Ч- и S-вирусы — {в томатах сорта Советский и Невский соответственно). Листья собирают через 3 — 4 недели после заражения и измельчают при помощи

ыясорубки. Вирус экстрагируют в рабочем буфере, обладающем стабилизирующими свойствами (0,05М лимоннакислый трехзамещеняый,натрий, 0,007М трилон Б и 0,2 /о-ный сульфит натрия) . Инфекционный сок осветляют кратковременным (5 — 6 мин) эмульгированпем с охлажденным хлороформом и низкоскоростным центрифугированием (20 мин, 3500 об|лшн), а очищают гельфильтрацией на хроматографической колонке, заполненной гелями на декстрановой основе.,Вирусы концентрируют, доведя рН до 4,0 трихлоруксус{{ОЙ к({слотой ffk{3{iocf{oP0c7{{h{XI центР{{фУГ{{Poванием (20 мин, 4000 об(мин). Полученный вирусный антиген вводят животным 2 раза внутримышечно с 1",„-ным гелем альгината натрия и желатина (1: 1) по 2,5 мл антигена с интервалом в 7 дней и внутривенно — по

1, 2, 3 л(л с однодневным {{нтервалом. Кровь отбирают на 7, 9 и 11-й день, и получают сыворотку по общепринятым методикам.

Полученные сыворотки строго специфические с высокими титраи. Титры kIBTHBklkfx сывороток к вирусам картофеля приведены в табл. 1. Таблица (Тито сыворотк{t к Bttpvc j картофеля

Ба{виват Они;т»

S Ч

Конт р ол в (без адъ:.ованта)

64 512

П р и м ер 2. Для получения сыворотки лосле полного цикла иммунизации кроликов реиммунизируют путем 3 — 4-кратного внутривенного введения антигена. Вирусные антигены готовят аналогично примеру 1, при этом получают диагностические сыворотки с титром, превь{шающи м первоначальный в 8 раз.

Данные о влиянии реиммуиизации на титры сывороток к S- и М-.вирусам картофеля приведены в табл. 2.

Таблн(.а 2

15. Ч-в;(рз с картофеля!

S-вирус картофеля

Цикл и .1;.t н((зацип

Т:! T t КОЛ П- (ТИТО сь:ворот- честно i сыворотколичество ( кроликов, К .(К((ОЛИКОВ, Kk(1; 256 !2 !: 512

1(:.! .з(! ii,.;.-а пня

Рсиичунизац,(я: первая

13 i 1: 1024 !2, : 2048 (2 2048 . 9 4095 третья

Формула изобретения

1. Способ приготовления диагностических сьивороток {к вирусам растений, включающий .получение вирусного антигена из растенийна копителей путем ооветлення инфекционного сока с помощью низкоскоростного центрифугирования, эмульгирования хлороформом и

40 иммунизации животного, отличающийся тем, что, с целью повышения качества диагностических сывороток, в качестве растений-накопителей используют серологически неродственные растения, а перед низкоокоростным центрифугированием проводят экстрагирование рабочим буфером, и после эмульгирозания очищают вирусы гельфильтрацией на хроматографической колонке.

2048

512

4095

11((з(унизация с а "ъ:оваитсз( (1 -ны . Гель в(ел гтина с альгинато:;( иатр:.:я 1: !1

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гельфильтрацию проводят на комбинированной хроматографичеакой колонке, за55 полненной гелями на декстрановой основе.