Способ получения противоопухолевого препарата

Способ получения противоопухолевого препарата

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

.,;nba ;

МЬА М бттблис т з

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (111 520055

Со1ов Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительный к патенту (51) М. Кл.з С 12D 13 00 (22} Заявлено 07.03.67 (21) 1139070/13 (23) Приоритет 08.03.бб (31) 13784/бб (33) Япония

Опубликовано 30.06.76. Бюллетень № 24

Государственный комитет

Совета Министров СССР

53) УДК 576 8 097 (088.8) ло делам изобретений н открытий

Дата опубликования описания 27.08.7б (72) Лвторы изобретения

Иностранцы

Кабусики Каиша, Хайме Ькамо1о и Сабуро Косимура (Япония) И»остраги1ые фирмы

«Чугаи Сейяку Кабусики Каиша» и «Кийова Хакко Когио Кабусики Кайша» (Япония) (71) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ HP01 ÈÂOÎÉÓÕOËÅÂOÃO

П Р ЕПАРА1 А

Изобретение относится к области медицины.

Известен с locoo получения противоопухолевого препарата путем нагревания клеток гемоли1HHBCKol 0 с1рептококка в Te IQiiiic 30 >IHH при 56 С.

Однако такой способ не обеспечивает высокой специфической активности препарата.

С целью»овышсн»я специфической активности по предлагаемому способу клетки предварительно |инкубируют с пенициллином в концентрации 2ОООΠ— 60000 ед мл при 30 — 38 С в течение 10- 30 мнн, а потом нагревают при

38-- 50" С.

Спосоо осу1цествля1от следу1ощим O6paBOII.

Добавляют пенициллин к суспензии клеток гемолитического стрептококка в суспензионной среде до концентрации пенициллина свыше 25000 ед. на 1 мл суопензии, инкуои11уюг смесь при 30 — 38"С, а затем нагревают при

38 — 50" С. Продолжительность первой инкубации от 10 до 30 мин, второй — î- 20 до

60 мин.

Используют клетки микроортанизма Ыгср1ососсив llemoliiicIIs, выращенного в среде оез дополнительной глюкозы. Можно использовать бульон из мясного настоя с содержанием РНК или PHC от 0,5- до 1,0 j< (вес./об).

Вместо мясного настоя для получения питательной среды использую г другие естественные или полусинтетические cìåcH, однако оез содержания гл10козы, так как Она си.lьно CHIIжасг противоопухолевую активность. Срок выращивания микроорганизмов от 13 до 0 ча .

После выращивания возникшие клетки микроорганизма — кокки — огделяют центрифу1ч1рованиехl, полученный ОсадОк КОККоВ ВзвсlниBHiOT B C) СПЕ11ЗИО ННО11 CPCQC, HB»РНМСР, В P IIC I воре со; е1» л чше всего в осно11»о 1 рсдс

Ьср»геймера. ту среду с ph между о,о и 7,0 пî.ióHàþT путем дооавки мальтозы, монокiiлиифосфата (КНеРОч) и семиводного сср»окислого магния (МдЬО - (Н О) к дистиллиро15 ванной воде.

В качестве суспензионной среды используют и солевой раствор, забуферованный фосфатом.

Пенициллин можно дооавить раньше, т. е. к ранее указанной суспензионнои среде, или же

2Q к суспензии KQKKQB в суопензионной среде.

Наиболее эффективное количесl Во пеницил iHна превышает 25000 ед./мл.

Полученную суспензию кокков, содержащую пенициллин, сначала инк1оируот 10 — 30 мин

25 при 30 — 38 С, а затем нагревают 20 — 60 мин при 38 — 50 С. Наилучшие результаты получаются, если первая инкубация проводится прп

37 С B Tc»ение 20 мин, а Iioca1PQOBBTcльный нагрев — при 45 С в течение 30 мин. Протпво520055

65 опухолевая активность клеток гемолитического стрептококка увеличивается независимо от того, являются ли кокки вирулентными или авирулентными, одновременно вирулентность кокков сильно снижается и способность их к образованию стрептолизина S полностью исчезает.

Для получения препарата в форме, пригодной для введения его в организм, суспензии кокков после выращивания сообщают асептические свойства, и полученную асептическую суспензию разбавляют до желательной концен тр ации.

Пример 1. Определение оптимальной концентрации пенициллина в суспензии стрептококков (опыты с лротивораковыми клетками

in vitro u in vivo).

5Ки вые клетки гемолитического стрептококка, выделенные из 100 мл 20-часовой бульонной культуры, промывают два раза физиолотическим раствором (солевой раствор) и взвешивают в 5 мл основной среды Бернгеймера (ОСБ) . Полученную суспензию кокков дополнительно разбавляют ОСБ так, чтобы получить суспензии с концентрацией 1/5 и

1f l О.

К 0,5 мл солевого раствора пенициллина (от 2 до 32><104 ????.>

С другой стороны, подвергают центрифугированию в течение 5 мин при 1500 об/мин молочно-белую асцитичеокую жидкость (30 мл), откаченную из мышей с 8-дневной асцитической карциномой Эрлиха. Отделенные раковые клетки промывают один раз охлажденным солевым раствором, затем охлажденной ОСБ и вновь взвешивают в ОСБ так, чтобы получить концентрацию клеток 60>;10 ед./мл.

1 мл суспензии раковых клеток приливают к 3 мл суспензии кокков, предварительно обработанной пенициллином, и смесь ставят в термостат с температурой 37 С на 90 мин. Инку бированную суспензионную смесь используют для внутрибрюшинной инокуляции мышам, на каждую мышь берут по 0,5 мл раствора.

)Кивотных, которые погибают в течение опыта, .вскрывают для определения причини смерти, животных, которые выживают в течение

50 дней после инокуляции, забивают и вскрывают.

Одновременно проводят контрольные опыты с применением смеси из 0,5 мл раствора пенициллина (32X104 ед./мл), 2,5 мл ОСБ и

1 мл суспензии раковых клеток.

Суспензии кокков, предварительно обработанные пенициллином в концентрациях выше

2,7><104 ????.>

10 !

23

4

П р и м ер 2, Длительность лреинкубации гемолитического стрептококка в суспензии в

ОСБ, содержащей пенициллин.

Концентрация пенициллина поддерживается на уровне 2,7><10 ????.>

Пример 3. Противораковая активность

in vitro у различных препаратов стрептококков в отношении мышей-носителей рака. Кивые клетки гемолитического стрептококка из ЗОО мл 20-часовой бульонной культуры промывают дважды солевым раствором и затем взвешивают в 15 мл ОСБ. Начальную суспензию кокков разбавляют затем ОСБ в отношении 1: 5.

1. К 30 мл разбавленной суспензни кокков (1:5) приливают 6 мл раствора пенициллина (16>(104 ед./мл соленого раствора).

2. К 30 мл разбавленной суспензии кокков (1: 5) добавляют 6 мл солевого раствора: а) суепензию кокков, содержащую солевой раствор, инкубируют 20 мин при 37 С (A); б) суспензию кокков с солевым раствором инку1бируют в течение 20 мин при 37 С и дополнительно нагревают в течение ЗО мин при

45 С (Б). в) суспензию кокков с содержанием пенициллина инкубируют 20 мин при 37 С (B); г) суспензию кокков, содержащую пенициллин, инкубируют 20 мин при 37 С и дополнительно нагревают 30 мин при 45 С (Г).

В контрольных опытах мыши-носители раковых клеток получают смесь ОСБ — солевой раствор, ОСБ — раствор пенициллина и 4 сус пензии:

1) смесь ОСБ с солевым раствором инкубируют 20 мин,при 37 С (a);

2) смесь ОСБ с солевым раствором инкубируют 20 мин при 37 С и затем нагревают

30 мин при 45 С (б);

3) смесь ОСБ с пенициллином инкубируют

20 мин при 37 С (в);

4) смесь ОСБ с пенициллином инкубируют

20 мин при 37 С и затем нагревают 30 мин при 45 С (г).

Противораковую активность определяют следующим образом.

Откаченную молочную асцитическую жидкость мы ше с 8-дневной карциномой Эрлиха разбавляют солевым раствором до концентрации 23>10 раковых клеток на 1 мл.

Мышей (в каждой группе 6 штук) подвергают внутрибрюшинной инокуляции 0,2 мл суспензии раковых клеток и через 24 час им инъектиру ют по 0,5 мл испытуемого стрептококко вого препарата, эту же дозу вводят дополнительно в течение 4 последующих дней.

Из четырех стрептококковых препаратов препарат г, полученный путем нагревания суспензии кокков, предварительно обработанной пенициллином, более эффективен, чем все другие, 520055

Ма зготина

Составитель С.

Корректор А. Дзесова

Редактор Н. Спиридонова Техред Е.

Подурушина

Заказ 1828/8 Изд. Ме 1553 Тираж 575 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4,5

Сапунова, 2

Типография, пр.

Пример 4. Опыты по вирулентности различных стрептококковых препаратов.

Приготовляют 4 сус пензии кокков в ОСБ так же, как и в примере 3.

После этого приготовляют 4 стрептококковых препарата, обработанных различным образом: а) суспензию кокков в ОСБ инкубируют

20 мин при 37 С (препарат Б); б) суспензию в ОСБ с содержанием 2,Б)(>(104 ед./мл пенициллина, инкубируют 20 мин при 37 С (препарат П вЂ” Б).; в) суспснзию кокков в ОСБ инкубируют

20 мин при 37 С и затем нагревают 30 мин при 45 С (препарат Б — 45); г) успензию кокков в ОСБ с содержанием пенициллина 2,5 10" ед./мл инкубируют

20 мин при 37 С и затем нагревают 30 мин при 45 С (препарат П вЂ” Б — 45).

Каждый препарат разбавляют ОСБ и затем вводят мышам внутрибрюшинно. Мыши, которые получили препараты Б, П вЂ” Б, и

Б — П вЂ” 4i5 в разбавлении 1: 2 млн, погибли, тогда как препарат П вЂ” Б — 45 при разбавлении всего 2000 раз не был вирулентным для мьвшей.

Пример 5. Влияние пенициллина на способность к образованию стрептолизина S суспензией стрептококков (SZS-образовательная активность) .

В серию пробирок, в каждую из которых наливают по 3 мл сме=и из 2,5 мл исходной суспензии кокков (в ОСБ) и 0,5 мл раствора пенициллина (24X10" ед./мл); в другую серию пробирок — контрольных — наливают по

3 мл смеси из 2, 5 мл исходной суспензии кокков (в ОСБ) и 0,5 мл солевого раствора.

Все эти пробирки помещают на 20 мин в термостат с температурой 37 С. Затем по одной пробирке из каждой серии (с содержанием суспензии кокков 4+10" ед./мл пенициллина — из первой серии и суспензии кокков без пенициллина — из второй серии) помещают в водяной термостат с температурой О, 37, 45, 56 или 70 С на 30 мин. Обе смеси, обработанные указанным,путем, подвергают испытанию на SZS-образовательную активность кокков.

Нагревание при 45 С в течение 30 мин полчостью лишает кокки, взвешенные в ОСБ с

33

40 содержанием 4 10 ед./мл пенициллина, способности к образованию стрептолизина S.

Пример 6. К 100 мл бульона мясного настоя с содержанием 1 r пептана и 0, 5 r хлористого натрия добавляют PHC в таком количестве, чтобы получить О «8%-ный раствор PHC в .питательной среде. Среду стерилизуют, рН7,56.

Бульонную 20-часовую культуру гемолитического стрептококка (штамм SII) пересеивают в эту же среду и инкубируют 20 час при

37 С. Затем бульонную культуру охлаждают, центрифугируют, осажденные кокки дважды промывают солевым раствором и взвешивают в 5 мл ОСБ следующего состава: 675 мл мальтозы, 6 мл 20 /о-ного раствора монокалийфосфата, подщелоченного NaOH (до рН 6,9), l2 мл 2%-ного раствора семиводного сернокислого ъ1агния и 66 мл дистиллирован ной воды.

Полученную суспензию кокков разбавляют

ОСБ так, чтобы ооразовалась суспензия с десятикратным разбавлением, и к 2,5 мл этой разбавленной суопензии приливают 0,5 мл раствора пенициллина. Для получения этого раствора отдельно растворяют пенициллин

G как калиевую соль в солевом растворе до кон|центр ации 16 >(104 ед./мл, и смесь ин кубируют 20 мин при 37 С и затем нагревают

30 мин лри 45=C.

К полученной кокковой суопензии приливают 1 мл той же суспензии раковых клеток, которую используют в примере 1. Смесь инкубируют 60 мин при 3: C; каждой мыши инъектируют внутрибрюшинно по 0,5 мл смешанной суспензии.

Через 50 дней после инокуляции определяют число выживших животных. От рака погибла одна мьпшь, остальные 5 — живы. Их забива1от и вскрывают, признаков опухоли не обнаружено.

Формула изобретения

Способ получения противоопухолевого прег.арата путем нагревания клеток гемолитического стрептококка, отличающийся тем, что, с целью повышения специфической активности, клетки предварительно инкубируют с пенициллином в концентрации 25 000 — 60 000 ед./мл при температуре 30 — 38 С в течение

10 — 30 мин, а потом нагревают при температуре 38 — 50 С.