Способ получения адсорбентов для хроматографии

Патент 520370

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

О П И С А Н И Е

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Соэетскнх

Соцмалистнмвсннх

Республнн (ti) юозас (6l) Дополнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено22.01.75 (21) 2119084/05

{51) М. Кл. с Ов а э7/ОО

С 08 Ф 8/ОО с присоединением заявки №"

Гасударственный комитет бенета Мнннвтрве СССР не делан хзввретвннй н еткрьгпй (23) Приоритет(53) уДК 548.544 (088.8) (43) Опубликованд 05.07.76Звллетень №25 (45) Дата опубликования описания124.08.7б

Б. А. Клящицкий и B. Х. Митина (72) Авторы изобретения

Институт экспериментальной и клинической онкологии АМН СССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДСОРБЕНТОИ ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИИ

Изобретение относится к способам разделения бнополимеров, точнее к способам получения адсорбентов для биоспецифнчес.кой адсорбционной хроматографии вЂ” мето да выделения и очистки биополимеров и клеточных структур, основанного на био1 специфическом взаимодействии выделяемой

1макромолекулй с лигандом, ковалентно свя занным с нерастворимым носителем.

Известно, что наиболее эффективными 10 адсорбентами в биоспецифической хромато; графин являются адсорбенты, содержащие так;, называемую вставку" (spacetj, чаше всего . углеводородную цепочку, отделяюшую лягание ,от поверхности носителя. Это делает лиганд 15 ,стерически более доступным .для взаимодействия с активными центрами .биополимера.

Однако применение таких .гидрофобных угле;.водородных вставок вызывает неспецифичес:кую сорбцию белков, осложняющую их очист- 20 у.

Известен способ получения ацсорбентов, .содержащих в качестве вставки гидрофиль1ные полимерные вешества - альбумин бычьей сыворотки в нативном или денатурированйом"виде, присоединенный к носителю агаразе. Недостатком вставок белковой рй.

Ф ) роды является их полуфуикциональность",что может приводить к неспецифическим эф фектам, в частности, к связыванию биопо» лимеров. электростатическими силами. При соединение.лнгандов к такого рода носите лям требует довольно сложных химических операций,, особенно в случае лигандов бел . ковой природы.

11ель изобретения - упрошение процесса присоединения ляганда, повышение удельно го содержания лиганда в адсорбенте и улусе шение биоспепифичности адсорбента. Укаэайная цель достигается тем, что в качестве ! вставки используют природные или синте» тические инертные водорастворямые поли сахариды, например производные раэветв-! ленного декстрана, гликогена, декстрина и т.д, Предлагаемый способ получения адсорбентов для биоспецифической хроматографи» заключается во взаимодействии твердого носителя, например производных агарозы, 1с водорастворимым полисахаридом, содер52037u жащим функциональные грулйы, необходимые для ковалентного связывания с носителем (в количестве 1-5 функциональных групп на 100 моносахаридных остатков), с последуюшим присоединением лиганда путем предварительной активации полисахаридной вставки с помошью бромистого цииана, периодатного окисления илн других известных методов.

Способ позволяет получать устойчивые биоспецифнчесЗсие адсорбенты с высоким со держанием лиганда. Так, во всех случаях содержание лиганда на 1 мл адсорбента с полисахаридной вставкой примерно в 3 ра ,за превышало .содержание лиганда в ана1 огичных адсорбентах без вставки, В качестве носителей, наряду с агароэой, мо1 гут быть использованы производные полиакриламида, шарики из.пористого стекла н другие. Биоспецифнчность полученных адсорбентов обусловливается гидрофнльной, инертной природой полисахаридной вставки,1. ие несушей каких-либо гидрофобных или эа" ряженных групп.

Для активации вставки, применяются достаточно простые и хорошо разработанные методы, что позволяет присоединять к носителю как низкомолекулярные лиган-. ды, относяшиеся к различным классам органических соединений, так и белковые. лиI

:ганды. В последнем случае предлагаемый способ может быть использован и для иммобилизации ферментов.

П р и м e p 1. Получение биоспецифического адсорбента РНК-аэадекстрансефароэа (РНКаэа - рибонуклеаза).

А. Введение вставки в носитель "декстрансефароза".

К раствору 0,5 г карбокснметилдекстрана (мол. вес 40000, степень эамешения карбоксиметильными группами Т =5 на 100.ангидроглюкозных единиц) в 6мл воды добавляют 6 мл (упакованный объем) аллиноэтилсефарозы, содержашей 5 ф1 экв.

ЙНй- групп на 1 мл геля. РН смеси дсвоf дят до 4,7-5 с помошью 1 н. НС k и пос- тепенно добавляют раствор 20 мг хлоргид рата 1-этил- -3/3- димегиламинопропил/-кар бодиимида (ЭДК) в 3 мл воды. Реакционо ную смесь перемешивают 48 час при 20 Ся, поддерживая в течение! первого часа рН

4,7-5 с помошью 1 н. НС.f. Затем сефароэу отделяют, промывают водой (100 мл)

0,1 М ЙаНСО (100 мл) и вновь водой (100 мл) . Юля блокирования остаточных свободных N H>-групп суспенэию декстран сефароэы в 6 мл воды пере: ешивают 6 час при 20 С с 0,02 мл ледяной уксусной кис о лоты и 2 мг ЗДК, промывают 1 л воды и используют в следуюшей стадии.

Б. Присоединение лиганда: РНК- азадек страисефа роз а .

K суспензия 5,5 мл декстрансефароэы а 5,5 мл натриМосфатного буферного раст»

5 вора, рН 6, постепенно добавляют 130 мг периодата натрия, и смесь перемешивают

1 час при 20 C. Активированный гель про. мывают 100 мл воды и смешивают с рас . вором 40 мг РНК- аэы в 10 мл 0,1 М р ИаНСОЗ, содержашего 0,5 М ИаСС. Смесь о перемешивают 20 час при 20 С, затем пос тепенно добавляют свежеприготовленный раствор 100 мг боргидрата натрия в 5 мл о воды и перемешивают 1 час при 20 С. Иолученный биоспецифический адсорбент отделяют, промывают на пористом фильтре 250 мл 0,1 М ИаНСО + 0,5 М NoCf, затем пь ,50 мл 0,1 М ацетатного буферного раство

pa + 1 М ИаС.t, (рН 4) и 0,1 М боратного

@ буферного раствора + 1 М ИаС), (рН 8) (последние две промывки повторяют трижды)

По данным спектрафотометрического ака лиза и определения РНК-азной активности исходного белкового раствора и промывных вод, после присоединения белка содержание

РНК-аэы в адсорбенте составляет 6 мг/мл объема упакой щного.геля. Содержание PHKазы в адсорбеите; полученном, прямым присоединением фермента к СЙВ .- активирован ной сефарозе, не превышает 2-2,5 мг/мл обьема упакованного геля. Адсорбент моо жет храниться длительное время при 4 С в виде водной суспензия в присутствии

0,02% аэида натрия.

Пример 2 Получение биоспеци.М фического адсорбента РНК-аэаамилопектин

Ф сефароэа".

Адсорбент получают по методике, описаиной в примере 1, исходя иэ карбоксиме4Е тилового эфира амилопектина и аминоэтил сефароэы. Ио данным спектрофотометрического анализа и оппределения РНК-азной ак тивности, удельное содержание фермента в адсорбенте 6,5 мг/мл объема упакованнож геля.

1 Пример 3. Получение биоспеци- . .фического адсорбента гемоглобин-декстраи .сефароза .

А. Получение модифицированного декс- трана - этилендиамннокарбоксиметилдекстран .

K охлажденному до 4 С раствору 2 r карбокснметилдекстрана (мол. вес 40000, F-5j в 6 мл воды постепенно приливают

1,48 мл 50%-ного раствора этилендиами», на в воде, 2 мл воды и 5 мл..пиридина. К раствору добавляют при перемешивании

1,91 г дициклогексилкарбодиимида в 5 мл пиридина. Реакционную смесь перемешио

Е вают 48 час при 20 С, разбавляют 3

520370 объемами воды, осадок отделяют, фильтрат обрабатывает эфиром (3 х 30 мл), водный спой унариаакм. Остаток растворяют в 20 мп воды и вводят в колонку (9

100 мд) сефадекса 6 а 50 вода), Фрак- 5 ция, выкодяшие с искпючаканимся объемом,,объедини@а, упарнвают до 30 мп, подше- . лачивавт до рй 8-9; и полимер высажива» ют 2 объемами спирта. Осадок отделяют, пастираФт со. спиртом, затем с абсолютным о

"спиртомисушаткад Р О при 80 С/О,l мм в течение 5 час. Выход 1,2 г (60, 1%).

Найдено, %: К 1,3, что свидетельству ет о, модификации всех карбокси1летильных групп. 36

Б. Присоединение вставки к носителю декстрансефа роза".

Суспензию 2 г СИВг актявированной сефарозы 4В в 8 мл 0,1 М ИаНСО + 0,5 М

ЙаС(неремешивают 16 час при 4 С с

i150 мг атипеядиаминокарбоксиметипдекстрана,() 5) Затем.сефарозу промыва ют на пористом фильтре -î-ä-î-é "(50 мл,, 0,1 М апетатным буферным раствором (pH 4) (50 мп) и водой (110 мл). Сою ласно определению содержания азота в промывяых водах (по Кьельдалю), с сефа

, розой коваленко связывается 114 мг (76%) производяого декстрата.

Для блокирования Оставшихся ВКТНВНМх Е групп на сефарозе промытый гель перемео ,;н|ивают 2 час при 20 С с двумя объемами

1 М этанопамина при:рН 8, а" для блокирования И Н>-групп на полисахаридной вставке, не вступивших в реакцию с CNBtактивированной сефарозой, суспензию геля о в .воде перемешивают 6 час при 20 С с

0,02 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мг

"ЗДК. После промывки водой (100 мл) декс трансефарозу используют в следуюшей ста дии. . В. Присоединение лиганда "гемоглобиндекстрансефароза". о

К охлажденной до 4 С суспензии 7 мл (упакованный объем) декстрансефарозы, по пученной в примере ЗБ, в 7 мл воды.добав

)пяют при перемешивании 7 мл 2 М раствора Нй СО и затем 0,35 мл раствора бро2. з мистого циана в ацетонитриле (2 r CNB) мл 5©

МеСЙ) . Взвесь энергично перемешивают 2 мин, выпивают на пористый фильтр, быстро промывают 0,1 М М аНСОз, водой и 0,1 М

8aHCOa + 0,5 М И аС3 (по 100 мл). За-, ;тем активированный гель смешивают с раст» вором 40 мг гемоглобина в 8 мл О, 1 М ЙаНСО .+ 0,5 М NaCf, и смесь перемеши/ з о ! вают 20 час при 4 С. Промывание биоспе:цифического адсорбента проводят, как опи.сано в примере 1 Б, Согласно спектрофотометрическому ана лизу {при А 280 и 400 нм) адсорбент со" держит 6,2 мг белка/мл упакованного гелй.

Лдсорбент, полученный прямым присоедине: нием гемоглобина к С И В -активироваяной сефарозе, содержит 1,5 мг белка/мл геля.

Темно-коричневый адсорбент хранят при" о

4 С в воде в присутствии 0,02% азида натрия.

Пример 4. Получение биосйegh - . фического адсорбента "поли U --гликогенбио» гель марки Р-300" (поли U -полиуридиповая кислота}.

А. Введение вставки в носитель "глико генбиогепь Р-300".

Присоединение 0,5 r карбоксиметилгли когена (-5) к 5 мл аминоэтилбиогеля

P-300 проводили, как описано в примере

1А с помощью водорастворимого карбодиим яда.

B. Присоединение лиганда "поли Угли когенбиогель P-300", К перемешиваемой суспензии 5 мл гликогенбиогеля Р-ЗОО, полученной в примере 4А, в 10 мл смеси вода вЂ” 2 М Na+CO (1: 1) добавляют при охлаждении (4 С)

0,3 мл раствора бромистого циана в ацетонитриле (2 r CN В1 / мл МеС N). В момент присоединения бромистого циана наблюдается слипание шариков биогеля.

Смесь энергично перемешивают 1,5 мин и фильтруют, гель промывают на пористом фильтре О, 1 M NaHCOä, .водой и 0,1 М NaHC0 + 0,5 М ЙаС((по 75 мл). Про мытый гель вносят в раствор 6 мг поли 3

1 в 7 мл 0,1 М натрийфосфатного буферйо1 о раствора (pH 7,5), и смесь перемешивают

16 час при 4 С.

Полученный адсорбент промывают 50 мл

О,l М натрийфосфатного буферного рас твора и перемешивают 2 час с равным объемом 1 М этаноламина (рН 8) для бло. кирования остаточных активных групп на полисахаридной вставке. Затем адсорбент

1.. промывают 50 мл 90%-ного формамида в

10 мМ капийфосфатного буферного раство» ра (рН 7,5), содержащего 10 MM ЭДТА и 0,2% додецилсульфата и 50 мл 25;о-ного формамида в 50 MÌ трис-HCE,: буферйого раствора (рН 7,5), содержащего

10 мМ ЭДТА и О 7 М NaC(.

Количество присоединенного 1поли () определяют по адсорбции при,1 260 нм исходного раствора полинуклестида и про. мывных вод. Согласно спектрофотометри ческому анализу, удельное содержание ли.ганда составляет 536 мг/мл адсорбента. о ,Адсорбент хранят при 4 С в виде суспензии в присутствии 0,02% азпда натрия.

Формула нэобретения

Способ получения адсорбентов для кроматографнн путем присоединения-лнганда к носителю через вставку, о т л н ч аю ш и и с я тем, что, с налью уйрошения процесса присоединения лнганда, повышения удельного содержания пиганда в адсорбенте и улучшения биоспепнфнчности

„ дсорбента, носитель подвергают взаимодействию с инертными водорастворимыми

Жаисахаридами, содержащими функпиональ. ные группы в количестве 1»5 на 100 мо носахаридных остатков, обеспечивающие ковалентное связывание с носителем, с последующим присоединением лигандов пу тем предварительной активации полисакаридной вставки.

Составитель С. Вююхина

Редактор Л. Ушакова Темред.С, Габовда) Корректор Б. вегас, Заказ 2885/196 Тираж 629 Подписное

11НИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открыта..й

13.3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП «Патент«r. Ужгород, ул, Проектная, 4