Способ получения цефалоспорина с
Иллюстрации
Показать всеРеферат
ОПИСАНИИ
i МЗОБРЕТЕЙИЯ ! К ЛАТЕЯТУ т ава Советских
СОциалнсти жсийх
Республик () ) 521 849 фф ф "тць (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 12.08.72 (21) 1817762/13 (23) Приоритет — (32) 13.08.71 (31) 38149 (33) Великобритания (51) М. Кл
С 12 Á 9/04
Гесудвествеииь1й ивмитет
Свветв Мииктрвв СИР пе делам извбретений и е тиЙ (43) Опубликовано 15-07-76-Бюллетень № 26 ! (45) Дата опубликования описании 13.10.76 (53) УДК
615.779.932 (088.8) Иностранец
Франческо Джаргиул=> (Италия) (72) а втор н 3 о j) 1 е у =. н . "; я
Иностранная фирма
"Альфа Фармасьютики С. и, А" (Италия) (7т) Даявите(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕФАЛОСПОРИНА С
Изобретение отнес -:.-.я к области микробяоло ии K: олу = та о а1„ тиб1иoTHKQB
Известен с ;особ пол :кения цефалоспорина С ваключа.:ощнт р, i-. о,, 1 го i 1тамм
8650 культов, . g рт; о оч:;,оpтоyп. i p4 j
5 ч9137 (Q С(; ): 5. -,:3) .=.-;, ращивают в аэробных условиях н-- cpe,. с;держащей источники углерода органнчес«ие источники азота и серы, а также r..è -.-:оальные соли, при о, 27 С a:течение 70 "а . с последующим вы- тв делением иелэвого íp=„-,у«та известными приемами.
Однако известный сносов не обеспечивает высокого выхода целевого --родукта.
С целью повышения выхода антибиотика, используют щтам:;-. ГР QK05pQ3 go% sp Х
1 2 (АТСС 20338) . Св Р4 1ОБ Отт iQ>w штамм g 1, . является му i антом g е() то (Q $— оог. ы1т ж; ТСС 1.! 550, хранится в Американской к ллек ии культур за номером 20
АТСС 20339 и в . « нтральном бюро плесневых zyabTyp a Баэр не, Яидерланpsr Голландия) под т1омеро ., СВ э 5357 1. Серт са1Q8j>Qt i Um 5 штамм т 2 обладает следующими свойства?"i . 25
2 о
Колонии выращивают при 20 С в темнс те, а затем для образования пигмента на свету в течение 2 дней. После инокулнрова— ния через 12 дней производят макроскопические и микроскопические исследования (т. е. после 10 дней роста в темноте и
2 дней на свету).
А. Макроскопические свойства.
1. Агар на овсяной муке. Колонии достигают диаметра 13-15 мм за 12 дней, плоские белые или светло-желтые с очень тонко скрученной поверхностью и дрожжевидным внешним видом, края регулярные, несплошнь е, несколько свободные, растительный мицелий белый.
2. Агар на солодовом экстракте. Колоin диаметром 12-14 мм на 12-й день, плоские, светло-коричневые или светло-желтые с тонкими радиальными завитками, дрожжеподобные, края регулярные, несплощные, свободны";-. растительный мнцелий креМоВо — æåëть1ы.
3. Агар на картофеле — моркови. Вид такой:ке„как у . "ара на овсяной муке, но окраска темнее.
4. Сабораудный агар. Колонии достигают диаметра 10-13 мм через 12 дней, такого цвета, как у агара на солодовом экстракте, с заметными радиальными витками, некоторые из которых углублены около центра, многие, меньшие по размеру, у края колонии„ края почти сплошные, не совсем круглые.
5. Агар на кукурузной муке. Колонии достигают диаметра 15-18 мм через 12 дней, плоские, белые или светло-зеленые, дрожжевидные, регулярные, но несколько свободные края, растительный мицелий таКого же цвета.
Ки ь одной из растительных сред не наблюдают образование днффундируемого пигмента.
Б. Микроскопические свойства.
Наблюдение поверхности колоний показывает, что Бо всех растительных средах дрожжеподобный вид объясняется почти полным ;@
Отсутствием БОздушяОГО мицелия едиясГвеняыми воздушными структурами являются кояидифоры, которые возникают прямо из непрерывной поверхности базального мицелия. Базальный мицелий состоит из раз- р@ ветвленных, разделенных стенками швов шириной 2-3 мкм.
Фиалиды простые, поднимающиеся под прямым углом с базальных швов (ортофиадиды), иногда имеющие поперечные пере- ЗО городки близ их основания. Длина их 20-55, ширина 1,4-2,1 мкм в основании, сужа|отся к верхнему концу до 0,7-1,4 мкм.
Нет утолщенных стенок, проба яа хромофильные свойства базальной части фиалид отрицательна.
Кояидии собираются вместе в почти круглые слизистые головки на концах фиалид. Они однополяряые, двухкояусные, иногда сле.ка искривленные. 4О
Выращивание культуры ведут в глубинных условиях питательной среды при 20-30 С.
Источником углерода в питательной среде могут быть такие углеводы, как глюкоза, сахароза, галактоза, лактоза, фрук- 45 тоза, декстрин, растворимый и нерастворимый крахмал и свекловичная меласса, Угдеводы в питательную среду вводят в виде смеси моно-, ди- и полисахаридов. Кожеятрация углеводов в питательной среде должна 33 быть 2-10 вес.%.
В питательной среде должны быть глицериды или гидролизованные глицериды, например оливковое, арахисовое, кукурузное масло. Количество глицеридов или про- @ дуктов их гидролиза в питательной среде
1-8 вес.%.
Питательная среда содержит также органический источник азота, которым служит растительж и или животный протеин Е или продукт его разложения или гидролиза, например полипептиды, пептон, триптон или аминокислоты.
Органическим источником азота является муKB из хлОпкОБых семян> рыбнаяэ мяс ная, маисовая, пшеничная мука, мука бобовых, дрожжевой экстракт, мясные экстракты.
В качестве неорганической соли в питательной среде могут использовать углекислый кальций, буру, уксуснокислый аммоний, сульфат аммония или фосфаты щелочных металлов. Эти соли содержатся в питательной среде в количестве 0,5 — - 1,5 вес.%, способствуют лучшему биосинтезу цефалоспорина С.
В качестве органического источника серы используют метиояин в количестве 0,52,5 вес.%, а также серусодержащие органические соединения YHKHe KBK тиогликслевая кислота, тиоуксусная кислота, метилтиогликолят,. метилтиоацетат, ояи содержатся в питательной среде в количестве 0,051 Бес.%.
Способ получения цефалоспорияа С осуществляют следующим образом.
Сначала культуру выращивают на скошенной агаризованной среде (косом агаре), содержащей среду для выращивания, в течение 10-15 дней при 2<30 С. Выращено ный мицелий промывают водой и полученный раствор используют в качестве посевного материала для посевной среды. Посевную среду выдерживают в аэробныхусловиях при перемешивании при 25-30 С в течение 4-8-96 час. Полученную посевную среду используют для ияокуляции конечной среды выращивания и в конечную среду выращивания вносят в количестве 5 вес.% От веса фермеятациояной среды.
Выращивание в инокулиров анной конечной среде осуществляют в течение 96-130 час при 2С -30, цредпочтительно 22-28 С.
Выход полученного цефалоспорина С определя от спектрофотометрически или микробиологически. Способ осуществляют в виде непрерывного процесса. Периодически отбирают (выводят) часть фермеятационного бульона и Б культуру вносят соответствующий объем свежей среды. Обычно это делают после начального периода выращивания (культивирования) 75-110 час. Свежие питательные вещества вводят в систему при помощи непрерывно действующего насоса, а количество элюеита регулируют таким образом, чтобы обеспечить постоянство рабочего объема и плотности популяции в фермекгере, Степень разбавления нецрерывной культуры поддерживают 0,2-0,8 предпочтительно 0,4-0,5 объема/день.
521849
Ацетат аммония 0,6
Сахароза 2 и инкубацией инокулированной среды в а=щ ру м и ко -"б= ч тcò . Q 7 IAc TTpH
24-28 С.
Инокулиров анны и ферментер, содержаший питательную среду, выдерживают 130 час о при 22-28 С и в течение этого периода поддерживают уровень аэрации в lл/мин при перемешивании со скоростью 300450 об/мин. Полученная культура содержит
4500-5000 мкг/мл цефалоспорина С (среднее значение).
Пример 2. Ростс lдмкосого агара культуры СОphà1îüÐîç оп Sp-штамм
F l2 суспендируют в 5 мл стерильной воды и используют для инокуляции 500 мл посевной среды, следующего состава, ч.:
Замочная маисовая жидкость 25
Ca: .8ï оза 20
Ацетат аммония 4,5
Лярдойль 0,5
Вода До 1000
Зат-ем инокулированную среду инкубируо ют при 24-28 С в качалке с 220 об/мин в течение 72 час в присутствии различных соединений серы в количестве одного эквивалента серь". (0,01 моля в 1000 мл).
Затем по 60 мл каждой из сред (1- .Л ), приведенных в табл. 1, ичокулируют полученной вегетативной средой и выдерживают о
l.i 4 час при 22-28 С в колбе-качалке с
250 об/мин.
Таблица 1
0 о2
Ниже приведен выход цефапоспорина С (ьыг/
Выход цефалоспорина С 100
11ефалоспорин С выделяют из культурной жидкости обычными способами, полученную неочищенную ферментационную смесь очищают фильтрацией, пропусканием через активированный уголь, адсорбцией на ионообменной смоле, элюированием водным основанием, например пиридином, и упариванием растворителя до получения кристаллического вещества.
Пример 1. В аэрируемый ферментер из нержавеющей стали (с мешалкой) емкостью 27 л вносят питательную среду следуюшего состава, ч:
Арахисовая мука 60
Крахмал 40
Метил олеат
Лярдойль 60
Сахароза 5
Э -Глюкоза 7
Углекислый кальпий 10
Бура 0,5
QL -Метионин 15
Вода Дс 1000 рН среды доводят до 7,2-7,8 и среду стернлизуют паром гри 120 С в течение
25-30 мин.
Ферментер затем инокулируют 5-10 об.
% культуры Сephalospo + <Р-штамм Г 12, полученной инокуляцией спор микроорганизма в среду следующего состава, 4:
Лярдойль О,l
Замочная жидкость маиса (пшеницы ) 2
Тиоуксусная кйслота
Тиогликолевая кислота
1 0,76 ( (Qo i 000
;л собранной среды).
11 11 П
100 160 100
521849
Та блиц а 2
Концентрация це-! фалоспорнна С
/..,1к г мл
Продолжит ель ность выращивания, час
2090
140
20 Q
2375
2 00,>1 30
2210
284
О 7 с 3 > о
2200
ОO
Пример 3. Инокулируют посевной средой, полученной в примере 2, 60 мл среды следующего состава, ч.
Арахисовая мук ч 60
Крахмал 40
Метиололеат 6
Лярдойль 60
Сахароза 5
Нерелоза 7
Углекислый кальций 10
Бура 0,5
l3L -Серии
Тиоуксусная кислота 1
Вода До 1000
Инокулированную среду ннкубируют при о
22-28 С в колбе-качалке с 250 об/мин в течение 100 час и получают бульон, содержащий 330-360 мкг/мл цефалосгорина С
Пример 4-. Повторяют опыт примера 1, но берут питательную среду следующего состава, ч:
Арахисовач мука
Крахмал 60
Метилолеат о
Сахароза 5
Глюкоза 7
Углекислый кальций 10 сну ра 0,5
3 - --Метионин 1 5
Вода До 1000
Полученная культура содержит .4500—
5000 кг/мл цсфалоспорина С, Пример 5. В аэрируемый ферментер из нержавеющей стали с мешалкой емKOCThIO 27 JI HHOCHT IIHTGTeIibRJJIO среду следующего состава, ч:
Арлхисовая мука о0
Крахмал 40
Метилолеат 25
Сахароза 5
Э -Глюкоза 7
Углекислый кальций 10
Бура 09 щ Э -Метионин 15
Вода До 1000 рН доводят до конечного значения 7,2 о
7,8 и среду стерилизуют паром при 120 С в течение 20 мин. Ферментационную среду уб инокулируют 5-10 об.% культуры Ceyhatosparzvm р., полученной инокуляцией спор микроорганизма в следующую среду (части на 1000):
J бУРдойль 1
Замочная жидкость маиса 20
Й.етат аммония 6
Сахароза 20 и инк тбациеи ипокулированно1, среды в аэ рпруемой колбе 72 час при 26-30 С.
25 Инокулированный ферментер,, содержащий питательную среду„выдерживают 92 час при 22-28 С. В культуральш; и котел по— дают культуральну о среду из расчета
260 мл/=Iàc„, так чтобы степень pàçáàâëåHèÿ
ЗО достигла О, 25 Объем/день. Температуру выдерживают B интервале 22-24ОС пере— мешивают со скоростью и50 Об, i .<ин, Qoij,— держивают уровень аэрации 0,5-1 л/мин в теченис всего процесса выращивания. За
Д5 .з. 5 дней От начала непрорывнОгО процесса собирают :-.,6 л среды с концентрацией це алоспорина С, указанной в табл. 2. (0
I Jp. доггжение табл. 2 ентрация це-, порина С, кг/ мл
356
380
428 (9f .
Собранный объем О, на всех последующих этапах — 6240 мл. .ос..1 авг*" и —. (.. г 4ыюг и-
Релактор 1.. вторила Техрел Л, Ле.льяиова Коррехт< >р .:, >.юлдн жар,>аказ 321:3/. 552 Тираж 57:> f 1одпястго "
HffHHHff Государственного комля т-, Со» "!, 5игц с-цзов < <,г . - ът<1 Jlf 17 е3м и, 3Г1опе д е ция и о г |if)l ! ни
1 13033, М<гсквч, Ж -3. >, Ра и окая л.б,, 1. .".г
Фили:цг Г1l ff I l l-.n с нт", 1.. У;+;г:;>оп, г! „ 1ро." г.иi
Формула изобретения
Способ получения цефалоспорина С, пу.м выращивания культуры рода Cephu Coriumm на среде содержащей источники уг2000
2070 лерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода антибиотика, используют штамм СерЬа1.osporium spF 12 (ATCC
20339) .