Способ получения цефалоспорина с

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИИ

i МЗОБРЕТЕЙИЯ ! К ЛАТЕЯТУ т ава Советских

СОциалнсти жсийх

Республик () ) 521 849 фф ф "тць (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 12.08.72 (21) 1817762/13 (23) Приоритет — (32) 13.08.71 (31) 38149 (33) Великобритания (51) М. Кл

С 12 Á 9/04

Гесудвествеииь1й ивмитет

Свветв Мииктрвв СИР пе делам извбретений и е тиЙ (43) Опубликовано 15-07-76-Бюллетень № 26 ! (45) Дата опубликования описании 13.10.76 (53) УДК

615.779.932 (088.8) Иностранец

Франческо Джаргиул=> (Италия) (72) а втор н 3 о j) 1 е у =. н . "; я

Иностранная фирма

"Альфа Фармасьютики С. и, А" (Италия) (7т) Даявите(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕФАЛОСПОРИНА С

Изобретение отнес -:.-.я к области микробяоло ии K: олу = та о а1„ тиб1иoTHKQB

Известен с ;особ пол :кения цефалоспорина С ваключа.:ощнт р, i-. о,, 1 го i 1тамм

8650 культов, . g рт; о оч:;,оpтоyп. i p4 j

5 ч9137 (Q С(; ): 5. -,:3) .=.-;, ращивают в аэробных условиях н-- cpe,. с;держащей источники углерода органнчес«ие источники азота и серы, а также r..è -.-:оальные соли, при о, 27 С a:течение 70 "а . с последующим вы- тв делением иелэвого íp=„-,у«та известными приемами.

Однако известный сносов не обеспечивает высокого выхода целевого --родукта.

С целью повышения выхода антибиотика, используют щтам:;-. ГР QK05pQ3 go% sp Х

1 2 (АТСС 20338) . Св Р4 1ОБ Отт iQ>w штамм g 1, . является му i антом g е() то (Q $— оог. ы1т ж; ТСС 1.! 550, хранится в Американской к ллек ии культур за номером 20

АТСС 20339 и в . « нтральном бюро плесневых zyabTyp a Баэр не, Яидерланpsr Голландия) под т1омеро ., СВ э 5357 1. Серт са1Q8j>Qt i Um 5 штамм т 2 обладает следующими свойства?"i . 25

2 о

Колонии выращивают при 20 С в темнс те, а затем для образования пигмента на свету в течение 2 дней. После инокулнрова— ния через 12 дней производят макроскопические и микроскопические исследования (т. е. после 10 дней роста в темноте и

2 дней на свету).

А. Макроскопические свойства.

1. Агар на овсяной муке. Колонии достигают диаметра 13-15 мм за 12 дней, плоские белые или светло-желтые с очень тонко скрученной поверхностью и дрожжевидным внешним видом, края регулярные, несплошнь е, несколько свободные, растительный мицелий белый.

2. Агар на солодовом экстракте. Колоin диаметром 12-14 мм на 12-й день, плоские, светло-коричневые или светло-желтые с тонкими радиальными завитками, дрожжеподобные, края регулярные, несплощные, свободны";-. растительный мнцелий креМоВо — æåëть1ы.

3. Агар на картофеле — моркови. Вид такой:ке„как у . "ара на овсяной муке, но окраска темнее.

4. Сабораудный агар. Колонии достигают диаметра 10-13 мм через 12 дней, такого цвета, как у агара на солодовом экстракте, с заметными радиальными витками, некоторые из которых углублены около центра, многие, меньшие по размеру, у края колонии„ края почти сплошные, не совсем круглые.

5. Агар на кукурузной муке. Колонии достигают диаметра 15-18 мм через 12 дней, плоские, белые или светло-зеленые, дрожжевидные, регулярные, но несколько свободные края, растительный мицелий таКого же цвета.

Ки ь одной из растительных сред не наблюдают образование днффундируемого пигмента.

Б. Микроскопические свойства.

Наблюдение поверхности колоний показывает, что Бо всех растительных средах дрожжеподобный вид объясняется почти полным ;@

Отсутствием БОздушяОГО мицелия едиясГвеняыми воздушными структурами являются кояидифоры, которые возникают прямо из непрерывной поверхности базального мицелия. Базальный мицелий состоит из раз- р@ ветвленных, разделенных стенками швов шириной 2-3 мкм.

Фиалиды простые, поднимающиеся под прямым углом с базальных швов (ортофиадиды), иногда имеющие поперечные пере- ЗО городки близ их основания. Длина их 20-55, ширина 1,4-2,1 мкм в основании, сужа|отся к верхнему концу до 0,7-1,4 мкм.

Нет утолщенных стенок, проба яа хромофильные свойства базальной части фиалид отрицательна.

Кояидии собираются вместе в почти круглые слизистые головки на концах фиалид. Они однополяряые, двухкояусные, иногда сле.ка искривленные. 4О

Выращивание культуры ведут в глубинных условиях питательной среды при 20-30 С.

Источником углерода в питательной среде могут быть такие углеводы, как глюкоза, сахароза, галактоза, лактоза, фрук- 45 тоза, декстрин, растворимый и нерастворимый крахмал и свекловичная меласса, Угдеводы в питательную среду вводят в виде смеси моно-, ди- и полисахаридов. Кожеятрация углеводов в питательной среде должна 33 быть 2-10 вес.%.

В питательной среде должны быть глицериды или гидролизованные глицериды, например оливковое, арахисовое, кукурузное масло. Количество глицеридов или про- @ дуктов их гидролиза в питательной среде

1-8 вес.%.

Питательная среда содержит также органический источник азота, которым служит растительж и или животный протеин Е или продукт его разложения или гидролиза, например полипептиды, пептон, триптон или аминокислоты.

Органическим источником азота является муKB из хлОпкОБых семян> рыбнаяэ мяс ная, маисовая, пшеничная мука, мука бобовых, дрожжевой экстракт, мясные экстракты.

В качестве неорганической соли в питательной среде могут использовать углекислый кальций, буру, уксуснокислый аммоний, сульфат аммония или фосфаты щелочных металлов. Эти соли содержатся в питательной среде в количестве 0,5 — - 1,5 вес.%, способствуют лучшему биосинтезу цефалоспорина С.

В качестве органического источника серы используют метиояин в количестве 0,52,5 вес.%, а также серусодержащие органические соединения YHKHe KBK тиогликслевая кислота, тиоуксусная кислота, метилтиогликолят,. метилтиоацетат, ояи содержатся в питательной среде в количестве 0,051 Бес.%.

Способ получения цефалоспорияа С осуществляют следующим образом.

Сначала культуру выращивают на скошенной агаризованной среде (косом агаре), содержащей среду для выращивания, в течение 10-15 дней при 2<30 С. Выращено ный мицелий промывают водой и полученный раствор используют в качестве посевного материала для посевной среды. Посевную среду выдерживают в аэробныхусловиях при перемешивании при 25-30 С в течение 4-8-96 час. Полученную посевную среду используют для ияокуляции конечной среды выращивания и в конечную среду выращивания вносят в количестве 5 вес.% От веса фермеятациояной среды.

Выращивание в инокулиров анной конечной среде осуществляют в течение 96-130 час при 2С -30, цредпочтительно 22-28 С.

Выход полученного цефалоспорина С определя от спектрофотометрически или микробиологически. Способ осуществляют в виде непрерывного процесса. Периодически отбирают (выводят) часть фермеятационного бульона и Б культуру вносят соответствующий объем свежей среды. Обычно это делают после начального периода выращивания (культивирования) 75-110 час. Свежие питательные вещества вводят в систему при помощи непрерывно действующего насоса, а количество элюеита регулируют таким образом, чтобы обеспечить постоянство рабочего объема и плотности популяции в фермекгере, Степень разбавления нецрерывной культуры поддерживают 0,2-0,8 предпочтительно 0,4-0,5 объема/день.

521849

Ацетат аммония 0,6

Сахароза 2 и инкубацией инокулированной среды в а=щ ру м и ко -"б= ч тcò . Q 7 IAc TTpH

24-28 С.

Инокулиров анны и ферментер, содержаший питательную среду, выдерживают 130 час о при 22-28 С и в течение этого периода поддерживают уровень аэрации в lл/мин при перемешивании со скоростью 300450 об/мин. Полученная культура содержит

4500-5000 мкг/мл цефалоспорина С (среднее значение).

Пример 2. Ростс lдмкосого агара культуры СОphà1îüÐîç оп Sp-штамм

F l2 суспендируют в 5 мл стерильной воды и используют для инокуляции 500 мл посевной среды, следующего состава, ч.:

Замочная маисовая жидкость 25

Ca: .8ï оза 20

Ацетат аммония 4,5

Лярдойль 0,5

Вода До 1000

Зат-ем инокулированную среду инкубируо ют при 24-28 С в качалке с 220 об/мин в течение 72 час в присутствии различных соединений серы в количестве одного эквивалента серь". (0,01 моля в 1000 мл).

Затем по 60 мл каждой из сред (1- .Л ), приведенных в табл. 1, ичокулируют полученной вегетативной средой и выдерживают о

l.i 4 час при 22-28 С в колбе-качалке с

250 об/мин.

Таблица 1

0 о2

Ниже приведен выход цефапоспорина С (ьыг/

Выход цефалоспорина С 100

11ефалоспорин С выделяют из культурной жидкости обычными способами, полученную неочищенную ферментационную смесь очищают фильтрацией, пропусканием через активированный уголь, адсорбцией на ионообменной смоле, элюированием водным основанием, например пиридином, и упариванием растворителя до получения кристаллического вещества.

Пример 1. В аэрируемый ферментер из нержавеющей стали (с мешалкой) емкостью 27 л вносят питательную среду следуюшего состава, ч:

Арахисовая мука 60

Крахмал 40

Метил олеат

Лярдойль 60

Сахароза 5

Э -Глюкоза 7

Углекислый кальпий 10

Бура 0,5

QL -Метионин 15

Вода Дс 1000 рН среды доводят до 7,2-7,8 и среду стернлизуют паром гри 120 С в течение

25-30 мин.

Ферментер затем инокулируют 5-10 об.

% культуры Сephalospo + <Р-штамм Г 12, полученной инокуляцией спор микроорганизма в среду следующего состава, 4:

Лярдойль О,l

Замочная жидкость маиса (пшеницы ) 2

Тиоуксусная кйслота

Тиогликолевая кислота

1 0,76 ( (Qo i 000

;л собранной среды).

11 11 П

100 160 100

521849

Та блиц а 2

Концентрация це-! фалоспорнна С

/..,1к г мл

Продолжит ель ность выращивания, час

2090

140

20 Q

2375

2 00,>1 30

2210

284

О 7 с 3 > о

2200

ОO

Пример 3. Инокулируют посевной средой, полученной в примере 2, 60 мл среды следующего состава, ч.

Арахисовая мук ч 60

Крахмал 40

Метиололеат 6

Лярдойль 60

Сахароза 5

Нерелоза 7

Углекислый кальций 10

Бура 0,5

l3L -Серии

Тиоуксусная кислота 1

Вода До 1000

Инокулированную среду ннкубируют при о

22-28 С в колбе-качалке с 250 об/мин в течение 100 час и получают бульон, содержащий 330-360 мкг/мл цефалосгорина С

Пример 4-. Повторяют опыт примера 1, но берут питательную среду следующего состава, ч:

Арахисовач мука

Крахмал 60

Метилолеат о

Сахароза 5

Глюкоза 7

Углекислый кальций 10 сну ра 0,5

3 - --Метионин 1 5

Вода До 1000

Полученная культура содержит .4500—

5000 кг/мл цсфалоспорина С, Пример 5. В аэрируемый ферментер из нержавеющей стали с мешалкой емKOCThIO 27 JI HHOCHT IIHTGTeIibRJJIO среду следующего состава, ч:

Арлхисовая мука о0

Крахмал 40

Метилолеат 25

Сахароза 5

Э -Глюкоза 7

Углекислый кальций 10

Бура 09 щ Э -Метионин 15

Вода До 1000 рН доводят до конечного значения 7,2 о

7,8 и среду стерилизуют паром при 120 С в течение 20 мин. Ферментационную среду уб инокулируют 5-10 об.% культуры Ceyhatosparzvm р., полученной инокуляцией спор микроорганизма в следующую среду (части на 1000):

J бУРдойль 1

Замочная жидкость маиса 20

Й.етат аммония 6

Сахароза 20 и инк тбациеи ипокулированно1, среды в аэ рпруемой колбе 72 час при 26-30 С.

25 Инокулированный ферментер,, содержащий питательную среду„выдерживают 92 час при 22-28 С. В культуральш; и котел по— дают культуральну о среду из расчета

260 мл/=Iàc„, так чтобы степень pàçáàâëåHèÿ

ЗО достигла О, 25 Объем/день. Температуру выдерживают B интервале 22-24ОС пере— мешивают со скоростью и50 Об, i .<ин, Qoij,— держивают уровень аэрации 0,5-1 л/мин в теченис всего процесса выращивания. За

Д5 .з. 5 дней От начала непрорывнОгО процесса собирают :-.,6 л среды с концентрацией це алоспорина С, указанной в табл. 2. (0

I Jp. доггжение табл. 2 ентрация це-, порина С, кг/ мл

356

380

428 (9f .

Собранный объем О, на всех последующих этапах — 6240 мл. .ос..1 авг*" и —. (.. г 4ыюг и-

Релактор 1.. вторила Техрел Л, Ле.льяиова Коррехт< >р .:, >.юлдн жар,>аказ 321:3/. 552 Тираж 57:> f 1одпястго "

HffHHHff Государственного комля т-, Со» "!, 5игц с-цзов < <,г . - ът<1 Jlf 17 е3м и, 3Г1опе д е ция и о г |if)l ! ни

1 13033, М<гсквч, Ж -3. >, Ра и окая л.б,, 1. .".г

Фили:цг Г1l ff I l l-.n с нт", 1.. У;+;г:;>оп, г! „ 1ро." г.иi

Формула изобретения

Способ получения цефалоспорина С, пу.м выращивания культуры рода Cephu Coriumm на среде содержащей источники уг2000

2070 лерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода антибиотика, используют штамм СерЬа1.osporium spF 12 (ATCC

20339) .