Способ выделения фермента нейраминидазы холерных вибрионов

Способ выделения фермента нейраминидазы холерных вибрионов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

o n и с л н и Е;„,»437

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Соввтскин

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву2 (61) М. Кл.

С 07 4 7/02 (22) Заявлено 18.04,75(21) 2125729/28-13 с присоединением заявки №Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изооретеннй и открытий (23) Приоритет (43) Опубликовано 25.08.77,Бюллетень ¹ 31 (53) УДК663.53 (088,8) (45) Дата опубликования описания 28.09.77

Г. B. Самсонов, Л. К. Шатаева, Г. Q. Кобринский

Н, Н. Кузнецова, В. О. Соловьев и И. В. Домарадский (72) Авторы изобретения

Институт высокомолекулярных соединений АН СССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТА НЕЙРАМИНИДАЗЫ

ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ

Изобретение относится к области технологии ферментных препаратов.

Известен способ выделения нейраминидазы из культуральной жидкости трехкратным осаждением сульфатом аммония, с последующей экстракцией фермента водой из осадка и ионообменной хроматографией на колонке с ДЭНЭ-целлюлозой в градиенте концентрации хлористого натрия, Однако известный способ является дли- 10 тельным и не обеспечивает высокого выхода целевого продукта (1).

Цель изобретения — повышение выхода продукта и сокрашение времени.

Сушность изобретения состоит в том, что культуральную жидкость пропускают через карбоксильный катионит в водородной о форме при 15-25 С, рН 5,1, колонку с катионитом промывают 0,1-0,2 М ацетатным 20 буфером, рН 5,0.с добавлением хлористого кальция, десорбируют фермент с колонки

0,1-0,2 М фосфатным буфером, рН 6,0-6,5 при 5 С в присутствии стабилизатора

0,001-0,002%-ного раствора ацетонитрила 25 и из элюата гельхроматографией выделяют конечный продукт.

Пример 1, В ионообменпую колонку (диаметр 1,6; высота 5,0 см) загружают карбоксильный катионит КМТ с коэффициентом набухания 3,2-3,4 в водородной форме, размер зерен 0,1-0,25 мм. Черс.: колонку пропускают 300 мл культуральной жидкости холерного вибриона при рН 5, 1 со скоростью

100 мл/ч. При этом нейраминидаза полностью сорбируется на катионите: конт оль полноты сорбции осушествляют по ферментной активности нейраминидазы в культуральной жидкости на выходе пз колонки. Затем колонку промывают 0,1 М ацетатным буфером с рН 5,0 в присутствии 0,05 ; — ного хлористого кальция со скоростью 200 мл/ црп о

20 С. Расход буфера составляет 120 мл на колонку. Десорбцию нейраминидазы; проводят при 5 С 0,1 М фосфатным буфером в присутствии 0,003%-ного ацетонитрила при рН 6,0 со скоростью 20 мл/ч, Выход активности нейраминидазы прц десорбации составляет 50% по сравнению с активностью исходной культуральной жидкости.

524376

Составитель С. Малютина

Редактор В. Смирягина Техред 3„Фанта Корректор И, Гоксич

Заказ 3124/55 Тираж 553 Подписное

UHHNFIH Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Полученный элюат концентрируют в 10 раз на установке для ультрафильтрации с целлофаном в качестве фильтрующего материала.

° Концентрат гельхроматографируют по принципу группового разделения на колонйе с сефадексом Г-50. Гельхроматографию проводят в 0,85%-ном хлористом натрии в присутствии С,1%-ного хлористого кальция. Собирают первую белковую фракцию, которая содержит высокоактивфж нейраминидазу, Выход продукта составляет 38%.

П о и м е и 2. В ионообразную колонку

{диаметр 2,1; высота 8,0 см) помещают катионит КМТ в водородной форме с коэффициентом набухания 3,5; размер зерен

0,1-0,16 мм. Через колонку пропускают

600 мл культуральной жидкости холерных вибрионов при рН 5,1 со скоростью

150 мл/ч. Нейраминидаза полностью сорби руется на катионите, о чем можно судить по отсутствию нейраминидазной активности в фильтрате вп в ходе из колонки. Затем колонку промывают 0,2 М ацетатным буфером с рН 5,0 в присутствии 0,5%-ного хлористого кальция со скоростью .100 мл/ч о при 25 С. Расход буфера составляет ЗООмл на колонку данных размеров. Десорбцию нейраминидазы проводят при 5 С 0,15 М о раствором фосфатного буфера в присутс вии 0,001%-ного ацетонитрила при рН 6,4 со скоростью 39-45 млlч.

Выход активности нейраминидазы при десорбции с колонки состввляеч 40%, а концентрирование в пике происходит в 4 раза по сравнению с активностью в исх яной культуральной жидкости. Полученный . элюат концентрируют в 8 раз на установке для ультрафильтрации, в качестве фильтрующего материала используют ацетатцеллюлозную мембрану. Концентрат гельхроматографируют на колонке с сефадексом -50 при 5 С в

O„1 М растворе хлористого натрия в дристствии 0,1%-ного хлористого кальция. Собирают первую белковую фракцию, которая coig держит 32% активности от всей взятой на разделение активности нейраминидазы куль туральной жидкости.

Формула изобретения

Способ выделения фермента нейрамини.дазы холерных вибрионов путем ионообменной щ сорбции и десорбции, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода продукта. и сокращения времени, культуральную жидкость пропускают через карбоксильНый катионит В водородной форме при 1525 25 С, рН 5,1, колонку с катионитом промы. вают 0,1-0,2 М ацетатным буфером, рН 5,0 с добавлением хлористого кальция, десорбируют фермент с колонки 0,1-0,2 М фосфат-. ным буфером, рН 6,0-6,5 при 5оС в приЭО сутствии стабилизатора 0,001-0,002%-ного ацетонитрила и из элюата гельхроматогра-, ..фией выделяют конечный продукт.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Х Аичеь Сйетп-Boca 1960, 82,4113