Способ получения фиксированных на носителе биологически активных макромолекулярных соединений

Способ получения фиксированных на носителе биологически активных макромолекулярных соединений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОГ1 ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистимеских

Республик (l l) 526294 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлеио07.12.73 (21) 1980687/ 05 (23) Приоритет (32) 08. 12.72 (31) P 2260184.9 (33) ФРГ (43) Опубликовано25.08.76-Бюллетень № 31 (45) Дата опубликования описаиия25.06.77

Р

> (51) M. Кл.о

С 08 У 5124d/

//А 61 К 37/00

Государственный комитет

Совета Министров СССР оо делам изобретений и открытий (53) УДК 547.96 (088.8) Иностранцы

Дитер Яворек, Карл-Хайнц Боч, Гюнтер Вайманн (ФРГ)

Михаэль Нэльбек-Хохштэттер (Австрия) и Хельмут Детерманн (ФРГ) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Берингер Маннхайм ГмбХ" (71) Заявитель (ФРГ) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИКСИРОВАННЫХ НА НОСИТЕЛЕ

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Изобретение относится к способу изготовления макромолекулярных соединений, обладающих биологической активностью, фиксированных на поверхности нерастворимого носителя. Обычно макромолекулярные соединения, фиксированные на поверхности носителя, либо адсорбированы, либо после активации материала подложки соединены ковалентно.

Подобные поверхностные макромолекулярные соединения, фиксированные на носителе, на- н) пример ферменты, имеют значительные недостатки. В частности. их поверхностная концентрация невелика. Поскольку речь идет о биологически активных макромолеку лярных соединениях, при фиксировании на поверхности чаще всего активность понижается.

При поверхностном фиксировании на активированных или содержащих ионогенные группы носителях не все реактивные группы макромолекулярных веществ доступны, так что оп носитель содержит еще заряженные группы и плотность связи макромолекулярных соединений никогда не достигает ожидаемой величины согласно числу способных к соединеник> положений. Макромолекулярные соедине- 5 ния, фиксированные на носителе путем адсорбции, не являются универсальными,так как могут быть снова легко элюированы.

Известен способ получения макромолекулярных соединений, обладающих биологической активностью, фиксированных на носителе, заключающийся в том, что биологически активный протеин подвергают взаимодействию в водном растворе с соединением, которое содержит эпоксидную группу и способную вступать в реакцию сополимеризации двойную связь. Затем полученный продукт сополимеризуют с акриламидом и бифункциональным мономером, способным образовывать поперечные связи, с образованием сополимера с биологически активным протеином.

В этом сополимере биологически активный иротенн находится в состоянии распределения по всей массе. При этом распределение является статистическим, то есть на поверхности биологически активный протеин находится не в более высокой концентрации, чем внутри сополчмера.

Свою полную активность биоло гич ески активный протеин может проявить лишь только

526294 е, —: ...— ..il и, ходится на поверхносты, гормоны, и антитела, нуклеиновые кислоты, пептиды, порфирины, гемины, фосфатиды, цереброзиды, ганглюэзиды, глюкозиды и т.д. Сушественно, что макромолекула так велика, что она практически не может проникнуть в поры примененных молекулярных сит. Минимальная величина применяемых по изобретению соответствуюших макромолекуп поэтому зависит от размера пор применяемых молекулярных сит. Особенно предпочитаемые макромолекулы — это биологически активные протеины, в частности ферментно-активные протеины. ти::эпс ляr. 1. ПООКОЛЬКУ ЛИШЬ тОГда ОН оеэ пl.r ..".-"<: в::< 10етупен для вешеств, необхо,; .. :х г лэ.:, -.-1 :;:.. активный протеин, заключенН< " "" i < ОПО 1 ЛМЕ1<а, 1<РОЯВ<1ЯЕт CB010 QK т1<л<1-Ост .-и..:ь в очень малой степени и ..Иг: ь д.,. .; ".пр<-депеннь х условиях. Эти успо. .лл11 зак,п<эчаютс.1 в тог1, что необходимые пля реакции гешества должны иметь воз- 10 мохи:< О", r- и«-од11ффупдировать через поры сшито- с-полимера и к тому же достигнуть са<кхючонного в сополимере активного и;0 1, ., С<эвершецно очевидно, что высоко :а.; пг;11 cyoc:рат не может проник- 15 ..1ут. 01п.1г01-0 сспэпимера, нс даже

l. 1;:K0х ... .: .:. r:.i;I;iÑ C ÎCтратЫ ВСтупа10Т ВО, .-<а1;. .«-.. --:"..10 Очень медленно, поскольку 1епь .:,,;:::::-. : 11.,..0 1сходит диффузия через

В качестье соединения Б можно применять большое число соединений в зависимости от способности к взаимодействию с макромопекулярным соединением А, а также оТ вида получаемых сополимеров. Если макромолекула А содержит, например, аминокислоты, то применяют соединения, которые имеют способные к взаимодействию группы, такие как оксирангруппы, этиленимингруппы. галогенидгруппь<, галогенидкислотные, азидкислотные ангидридкислотные группы. Дальнейшие примеры показывают применение для ацилирования или алкилирования аминогрупп в пептидную и протеиновую группы, таких соединений как альдегиды, гидразиды, оксазалоны, смешанный хлормуравьиный эфир, эфир угольной кислоты с вторичным фосфорнокислым эфиром, вторичным мышьяковым эфиром, гидроксинитриловый эфир уксусной кислоты, N -гидроксисукцинамид, р-нитрофенол, полигалэгенфенэлы, дициклогексилкарбодиимид и фенилтриазин.Кроме того, смешанные ангидриды угольной кислоты с серной кислотой, имидазопид угольной кислоты.

При использовании других макромолекулярных соединений в соответствии с имеющимися, способными к соединению функциональными группами, применяют другие подходяшие алкилируюшие и ацилируюшие агенты. В случае нуклеиновых кислот допускаются по сушеству те же самые активные группы, как те, что применяются при протеинах и пептидах. Особенно псдходят здесь амиды кислот, такие как нормальный амид угольной кислоты, алкиламид, морофолид и т.д.

Многофу1лкциональное соединение Б может иметь одну или несколько групп, способных к соединению с макромолекулярным соединением А. Оно имеет предпочтительно группы одного вида.

Кроме того, этэ соединение должно содержать группу, способную к полимеризации нпи пэпиконденсации. Это, прежде всего,, <а: ",«; и:<О. ;1етеп11<а устраняет указанный

>, П >СЛ; r<<лкK, <1ПО 00;.:Даат ВОЗМОжНОСтЬ ТОГО, 1T0 20c.. 1: 1: «01 i ;ески активный протеин распола -ается в связанногл состоянии на и >верхг<ос; и Образовавшегося сопопимера и . ышь в I <значительном количестве находится в11, р« = ;0ã0 сопопимера. Это достигается путем,,оlо.пгпт-.льногс применения материала, I;.<0;icònLiræ0UIårî собой молекулярное сито, пар:,1 кото-:ого так малы, что примененньп биологически активный протеин не может п110<п<к 1 ь L пих.

Г1р0..1лагаемгдi» способ изготовления макроглэле1<у<1::1ып-.<х сэсдипепий, фиксированных на нссителе, состоит в том, что макромолекулярные со011ип0111:,.I А сначала подвергают .,Оаимсдейств1л10 с соединением Б, которое имеет rr0 меньшой мере одну функциональную г-дуплу, способну10 сс<ед11г1яться с макромолекулярнь<м соедин<а<нем А и, кроме того, име40 ет по меньшей мер<= . одпу способну о к полимеризации <11ункц11оцальну10 группу, затем дооавляют м0.-10кулярпоо сито с такой степенью сшивк .. (илп размерога пор), что через него

i . Он лк<пэт 1;Олекуль< макромопекулярного соедппе<лия А и, в слулае необходимости, спо001п..-1 сопэлимер11зациг! мономер, мОлекушрнэе сиа-с г1аб хает в реакционной среде

3 затем Осуш.ствляют п011имеризацию заклю— пенн<,<х вг1 три молекулярного сита соединений.

ТаКИМ 00ИЗО.<л, П< ЛУЧаЮт МаКРЭМОЛЕКУпярное соединение, финc;ip01lalьпое на носителе, ксвалентн;: с язапное с 1<оверхностью час-„. 1ыц полямерызата, котор1 и проникает в часTццы мэлекулярпых cliT, Макромэлекулярные соединения А в сээтнетствии с изобретением — этэ протеин, особенно биологически акти.-пый протеин, форг,1еп —;;

52? 62(1 1 двойные связи углерод-углерод, преимущественно, которые могут вступать в реакции гомополимеризацки и сополимеризацки, а также двойные связи углерод-кислород, как в карбонилгруппе и др; ОН вЂ” группы. изоцианатгруппы к капрслактамгруппы и т.д, Примерами соединений Б являются: 2,3-эпоксипрогиловый эфир акриловой кислоты, 2,3-бутеноксид, I-аллилокси-3-(N -этилениминпропанол-2), ангидрид маленковой

10 кислоты, амилброллид, акрилоилхлэрид, 2, 3—

-эпоксипропиловый эфир метакриловой ккслоты, 2,3-эпскскпропиловый моноэфир малеиновой кислоты, 1-(аллилокси)-2,3-эпоксибутан и т.д. 15

Применяеллые молекулярные сита должны иметь размер пор, не позволяющий проникать макромолекулярному соединению A к позволяющий проникать внутрь полифункциональному присоединяюшемуся соединению Б. Пред— почтительно это гелегиднь е молекулярные сита на основе сшитых т1олимеров, такке как полиакриламидгель, сшить:й углевод, например сшитый декстран, агар и т.д. Способным к полимеризацки мономером может быть 15 акркламид, метакриламид, эфир акриловсй кислоты и метиловый эфир акриловой кислоты, стирол к т.д. с cc,îò1 -åòñòâóþøèì количествэм сшивающегэ агента, как например, I

М Я -метилен-бис-акриламида, тетраэтилен- д> гликольдиметилкрилата или этилендиакрилата, дивинилбензэла и -.. a. Размер пэр регулируется копкчеством сшивающего агента, причем с повышением этого количества ргдкус пор сита уменьшается. Предпсчти — 35 тельны молекулягные сита на основе сшито— гс декстрана и производных акриловсй кислоты и метакриловой кислоты, особенно амида и эфира.

Молекулярные сита перед пслимеризацией полностью или частично подвергают набуханию, так как полимеркзация или сополимеризация соединения Б должна протекать внутри молекулярчого сита и потому осуществляют набухание молекулярных сит та45 ким образом, что поглощается раствор, в котором происходит соединение макромоле— кулярного соединения А с соединением Б, так что на поверхности молекулярных сит остается только макромолекулярная часть 50 продукта АБ. Объем реакционного раствора выбирают таким, что полного набухания молекулярных сит не происходит, так что этим обеспечивается прохождение окончательной полимеризации исключительно внутри молекулярных сит.

Путем соответствующей комбинации молекулярного сита с соединением Б и способной к полимеризации системой, а также в случае необходимости растворителя, можно каждый раз и-. желанию осуществлять полное заполнение и проникновение полимеризата в молекулярное сито или только поверхностное прон1.кновение при остающемся незаполненном полом пространстве внутри молекулярных сит.

Способная к полимеркзации система вы— бирается каждый раз с учетом сохранения в силе нужных свойств макромолекулярного соединения А, к примеру ферментной активности, допускаемых условий полимеризации, особенно температуры полимеризации к полимеризацконных свойств способного к полкмеризации соединения Б. Если в качестве макромолекулярного соединения A применяют тносительно термостабильную нуклекнову1о кислоту, то можно пригодное для пол1.конденсации при нагревачии сэединенке Б ир1.,i. нять в качестве е ннственного элемент; системы полкллеризации.

ECJIH ЛЛаКООЛЛОЛЕКуЛЯОНОЕ СОЕД11НЕНИе это терллочувствительнл 1й фермент, то целесообразно работать и условиях сополимеркзации с применением подходящих сом?номеров, например, акрилаллида в присутствии низкотемпературных катализаторов нопимеризац1н1, например, перекисей к, в случае нео ходимости, ускорителей и сшивающих агентов.

В качестве инициаторов используют обычные инициаторы к катализаторы, применяемые в полимерной хиллии, которые не оказывают отрицательного влияния на активность макромолекулярного соединения А. В качестве инициаторов или катализаторов применяются неорганические кли органические перекиси, азосоединения и т.д. Дополнительно могут быть применены ускорители реакции, такие как амины и др. При применении производных акриловой или метакркловой кислот в качестве соединения Б, обладающего снов собностью к полимеризацки, оказалось наиболее удобно применить комбинации инициаторов из пероксидисульфата и амина.

Применение сшивающих агентов в полимеризационной системе не является необходимым, так как полимеризация внутри яче— ек молекулярных сит придает получаемому полимеру свойства сетчатого полимера. Однако для модификации физических свойств все же целесоооразно применять сшивающий агент.

Полученное фиксированное на носителе макромолекулярное .::: ние имеет пре— восходную повеоi, >,,:.;тивность.

Прил:

1tcxo и.:.

Молекуляр 1- с11 ..:, . основе образующего сетчаты::1с.:элу, а,1 декстрана.

Глг ;; аа — -..". .-даза (220 1Л /ллг) 526294

Брэмцион.

1< 5 т сефадекс С -25 среды добавляют 75 ми < оды и 100 мл 25;6-ного раст«ера -ро.,1циана. Значение рН становится равны:: 1 1 и путем дозирования 2 н. натр сей ше>..о";и поддерживают рН в течение

> м;ш . >стоянным. Промывают О, М раст и.рокарбоната натрия. Сефадекс, активи:, ои:.:. ный оромцианом, смешивают с

200 м- глюко. ы — оксидазы, растворенной в 10 м-: 0,5 М триэтаиоламин-буфера,рН 8,0. 50

Г>еакциопиую смесь оставляют на 18 час

-;ри 4 C. Промывают 0,2 М дифосфат-буфером, рН 7,5. Удельная активнэсть полученног<> т, «т;. образом фермента, соединенного с ч с;, -ем, составляет 38 0 /г.

55 !

- санния фиксирования протеинов на сши.ом: кт;:,:;.;Ч>ованием бромцианом полисахари:>ассматривается как способ с сохранением паи .. .гшей активности. Сравнение примеров 1 и 2 показывает что, .несмотря Hd уд- 5п

Я { { -метилен-бис-акриламид

Хлорид акриловой кислоты

Хлористый метилен

Дисульфат перекиси аммония.

N -Диметпламинопропионитрил. 5

100 мг глюкозы — оксидазы растворяют в 5 мл 0,5М триэтаноламин-буфера, рН 8,0 и в атмосфере азота охлаждают до 10 С.

К этой реакционной смеси добавляют 0,03мл хлорида акриловой кислоты в 2 мл метилен- )p хлорида и 30 мин перемешивают. В этом протеиновом растворе, обработанном хлоридом акриловой кислоты, растворяют 0,8 r

f акриламида и 0,05 г N, М -метилен-бис-акриламида. Проводят полимеризацию 15 с 0,05 мл 5%-ного {{ — циметиламинэпропионитрилового раствора, G также с

G,05 мл 5 / — ным раствора перекиси дисульфата аммония. разу после этого дооавля1от к реакш.овцой смеси 5 г молекулярных сит Я (сэфадокс С;- -25,, среда,{ и перемешивают в атмось-.ре азота.

Объем реакционного раствора выбирают таким образом, чтобы его было недостаточно для полного набухания молекулярных сит 25 и не о:>разовалось единого полимеризационного блока, но произошла чолимеризация исключительно в гранулах молекулярных сит.

Полученные частицы суспендируют в 50 мл дистиллированной воды, перемешивают, фильт-30 руют и лиофилизируют.

Выход: Молекулярные сита Са. 5 г (в пересчете на лиофилизат). Удельная активность 1 С>0 U/ã лиофилизата.

Пример 2 (для сравнения ) .

Исходны<-: продукты:

Сефадекс C- -25, среда

Г;покоза — оксидаза (220 (> /мг) военное количество фермента, содержащегося на носителе, по известному способу получен продукт с активностью на 25% ниже активности, полученной по предлагаемому способу.

Полученный на введенном ферменте выход активности в 8 раз выше.

Пример 3.

Исходные продукты:

Молекулярные сита на основе полиакриламида.

Глюкоза-оксидаза (220 L{ /мг)

А криламид

N, N -метилен-бис-акриламид

Хлорид акриловой кислоты

Метиленхлорид

Дисульфат перекиси аммония

N -диметиламинэпрэпиэнитрил.

Инкубирование раствора фермента производят, как указано в примере 1. Сразу после добавления раствора инициатора добавляют 5 r молекулярных сит (биогель Р6 50100 меш) и перемешивают в атмосфере азота, Набухание молекулярных сит происходит в течение нескольких секунд.

Объем реакционного раствора выбирают таким образом, чтобы не было достигнуто полного набухания молекулярных сит, чтобы не образовался единый полимеризационный блок, а полимеризация протекала исключительно в гранулах молекулярных сит. Полученные частицы суспендируют в 500 мл дистиллированной воды, энергично перемешивают и фракционируют двумя типами сит с шириной ячейки 0.4 и 0,2 мм. Настицы

0,2-0,4 мм заполняют колонку диаметром

20 мм и элюируют 4л0,,2 М фосфат-оуфера; рН 7,5.

Выход. Молекулярные сита Са. 5 г (в пересчете на сухую массу„удельная активность 160 - /г (в пересчете на сухую массу).

Пример 4. Фиксация пэлиаденилэвэй кислоты (пэли А)

Исходные ирэдукты:

Поли А

Триэтвноламинбуфер (О, 5 М, р Н = 8, О )

Акрилоилхлорид

Эфир

Акриламид

Дисульфат перекиси аммония (5%)

N, hl -бис-акриламид !

Диметиламинопропионитрил (5% )

Сефадекс C -25, среда.

27„4 мг Поли А растворяют в 2 мл триэтаноламин-буфера и охлаждают до 10 С.

Этот реакционный раствор добавляют в атмосфере азота в 0,01 мл акрилоилхлорида, растворенного в 1 мл эфира и перемешивают

30 мин. Окончательно смешивают с 0,3 г

526294

Составитель Г. Русских

ТехРед Н. Бабурка

Корректор Н. Ковалева

Редактор Н. Джарагетти

Заказ 919/67 Тираж Подписное

1ЛНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и откоытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г, Ужгооод, ул. Проектная, 4 акриламида и 0,2 г N, N -метилен — бис-акриламида и 2 r сефадекс (» -25 и начинают полимеризацию с 0,02 мл диметиламинопропионитрила и 0,02 мл дисульфата перекиси аммония. Полученный продукт в гра 5 нулах вводят около 8 час в колонну и промывают 2,5 л О, 5 М раствора поваренной соли

Для доказательства фиксирования суспендируют сефадексом соединенный Поли A в

0,3 н. раствора едкого калия и гидролизуют 10 о в темноте при 37 С.

После гидролиза получают нуклеиновую кислоту, концентрация которой (10%) вычислена по привесу Поли А.

Предложенный способ дает возможность Л экономить дорогой и во многих случаях труднодоступный биологически активный протеин, поскольку он весь связывается на поверхности.

Формула изобоетен» я 20

1 . Способ получения фиксиров::" .-.; а носителе биологически активных мак :;.>лекулярных соединений путем взаимодействия биологически активного макромолекулярного соединения А с низкомолекулярным соединением Б, содержашим по меньшей мере одну группу, способную к полимеризации, и по меньшей мере одну группу, способную к взаимодействию с макромолекулярным соединением А, с последующей полимеризацией продукта взаимодействия АБ в растворе, о т— личаюшийся тем,что, сцельюувеличения биологической активности фиксированного на носителе соединения, к раствору продукта АБ перед полимеризацией добавляют молекуляоное сито с размером пор в набухшем состоянии, меньшим размера молекулы макромолекулярного соединения А, в количестве, достаточном для неполного набуха— ния в растворе продукта АБ.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю— ш и и с я тем, что полимердзацию продукта АБ прсводят в присутствии сополимеризуюшегося с ним соединения.