Способ получения -лизина

Способ получения -лизина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (") 826295

Г

1 (61) gIîïîëíèòåëüíûé к патенту (22) Заявлено 26.04.73 (21) 1912978/13

I (51) М. Кл.

С 12 Р 13/06 (23) Приоритет — (32) 27.04.72; 18.08.72;

1 9.09.72; 30.1 1. 72; (31) 42527; 82641; (33) Япония

94030; 120247 (43) Опубликовано25.08.76.Бюллетень № 31

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изооретений и открытий (53) УДК 663.1 (088.8) (45) Дата опубликования описания 15.12.76

Иностранцы

Кодзи Кубота, Ясухико Есихара, Хаяо Хиракава, Хиротака Камидза, Сигеки Носака, Фумихиро Есинага, Синдзи Окумура и Хироси Окада (Япония) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Адзиномото Ко, Инк." (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1 -ЛИЗИНА

У-108 АТСС 21798, АС-73 АТСС21799, АД-5 АТСС 21800, АД-162 АТСС21801, AT -3424 ФЕРМ P-171 1, AI -3425 ФЕРМ

Р-1712, AT -3429 ФЕРМ Р-1857, AJ—

3391 ФЕРМ P-1570, А3 -3394 ФЕРМ

P-1573, AJ -3395 ФЕРМ P-1574, АТ—

3396 ФЕРМ Р-1575, AI -3392 ФЕРМ

Р-1571 или AY -3393 ФЕРМ P-1572. Из рода Со yhebac

P-1984 или AT -3461 ФЕРМ P-1985, вид

3 Ици штамм АТ 34-64 ФЕРМ P-2026, вид aaetoacidophlfum штамм AI -3465

ФЕРМ P-2027.

В качестве ассимилируемого источника углерода можно использовать углеводы, уксусную кислоту, этанол, В качестве необходимых для роста веществ можно применять природные вещества.

В качестве аналога L -лизина рекомендован Я -(2-амино)- 1 -цистеин (АЭ11).

Индекс ФЕРМ P указывает на то, что штамм хранится в Исследовательском институте ферментации Управления прикладИзобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к получению аминокислот с помощью микробной ферме нтац и и.

Известен способ получения -лизина путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов, относящихся к одному из poaos3vevibachep urn Гovynebackevium, устойчивых к аналогам Ь -лизина, в питательной среде, содержащей усваиваемые источни- щ ки углерода и азота, неорганические соли, необходимые питательные вещества и органические вещества, стимулирующие рост, при рН от 5 до 9 (11.

С целью упрощения процесса и повыше- И ния выхода Ь -лизина из родовБ ещ5ас1а чцт и Cotvnebactev um предложено использовать мутантные штаммы, обладающие наряду с устойчивостью к аналогам лизина потребностью по крайней мере в одном соеди- Qp ненни, выбранном из группы, содержащей серии, пролин, алании, никотинамид,пантотвновую кислоту, тиамин, гуанин, гипаксантин и витамин В, а именно из родаЗт.еМЬас1еицтп используют вид 1псМеипеиЬ тп штамм 25

526295 ной науки и технологии Министерства торговли и промышленности Японии, откуда этот штамм может быть получен, Мутанты, нуждающиеся в определенном питательном веществе, были получены путем облучения исходного штамма рентгеновыми лучами или обработкой нитрозогуанидином и последующего выращивания кслоний на твердой питательной среде при

31оС в течение 4-10 суток.

tO

Питательная потребность выделенных ауксотрофных мутантов была определена известным способом.

Мутации устойчивости к аналогу L -лизина были получены путем повторной обработки ауксотрофных мутантов нитрозогуанидином и выращивания их на синтетической питательной среде с добавлением аналога и необходимого питательного вещества.

Некоторые мутанты были получены путем первоначального получения мутации устойчивости к аналогу лизина и последующего введения мутации ауксотрофности.

Преимуществом данного способа является получение нового типа мутантов, способ-, ных образовывать значительные количества

L --лизина.

Другим достоинством этого способа является отсутствие резкого влияния на биосинтез L -лизина колебаний в содержании

L -треонина так как штаммы устойчивы к аналогам L -лизина.

В качестве ферментационной среды можно использовать обычные среды, широко применяющиеся в производстве L -лизина.

Необходимо только, чтобы в питательной среде присутствовали вещества, нужные для роста мутанта. К числу таких веществ относятся аминокислоты серин, пролин, аланин, лейцин, различные витамины, например щ витамин В, тиамин, пантотеновая кислота, никотинамид (или никотиновая кислота), пуриновые основания, например гуанин, аденин, шпоксантин, белковый гидролизат соевых бобов, дрожжевой экстракт, пептон, 45 гидролизат казеина и др.

Одним из важных факторов процесса ферментации является содержание в среде требуемых аминокислот и других питательных веществ в количестве ниже того уровня, который является оптимальным для роста штамма.

Ферментацию проводят при аэрировании и перемешивании, в течение 24-96 час при температуре 24-37оС. рН среды поддерживают на уровне 5,09,0. Если рН среды в процессе ферментации становится меньше 5, то в среду добавляют мел или водный раствор аммиака.

Если в качестве источника углерода используют органические кислоты, то рН имеет тенденцию к повышению и его доводят до необходимого уровня с помощью кислот, например органической кислоты, которую используют в качестве источника углерода, а также с помощью соляной или серной кислоты.

-лизин выделяют из культуральной жидкости обычными методами. Бактериальные клетки могут быть отделены фильтрованием или центрифугированием, а лизин может быть извлечен с помощью катионнообменной смолы.

Полученный L -лизин идентифицируют с помощью бумажной хроматографии, методом электрофореза, микробиологическим методом или с помощью лизиндекарбоксилазы.

Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава: глюкоза — 10,0 /о, (й Н ) Я О„- 5,0%т КН РО4 - О, 1%>

Mg gO

Среду разливают по 20 мл в качалочные колбы объемом 500 мл и стерилизуют.

Колбы засевают штаммами, указанными в табл. 1.

526295

Табл ица

Выход L -лизина, г/100 мл среды

Шта мм

Brev bactet ЦасСоЕе .веп4 и m

У-108 (ФЕРМ P-1443) АТСС 21798

Влечь Ьас еи ит 3ас6оЕе ment urn

4,1

АС-73 (ФЕРМ P-1444) АТСС 21799

Н еиЬас ем um 3actoferrnenturn

2,5

АД-5 (ФЕРМ P-1445) АТСС 21800

В емЬасЕвиum Вас1оКе mentum

АД-162 (ФЕРМ P-1446) АТСС 21801

3,0

2,8

Ферментацию проводят в течение 72час на качалке при 31оС.

Количество полученного L, лизина (в 2О виде гидрохлорида)указано в табл. 1.

Питательная среда для штаммов АС-73 и АД-162 содержала 5 мг/л пантотената кальция и 100 мг/л аденина и гуанина соответственно. 25

Клеточную массу штамма У-108 и мел удаляют из культуральной жидкости центрифугированием. 1 л культуральной жидкости пропускают через колонку с катионообменной смолой (Амберлит 3 R-120). Затем

4 -лизин элюируют 3 /-ным водным раствором аммиака. Элюат концентрируют в вакууме. В сконцентрированный раствор добавляют соляную кислоту и помещают в холодильник для осаждения, -aaaHHe. 35

В результате получают 30,2 г неочищенного кристаллического L -лизина солянокисл ог о.

П рим ер 2.Штаммытеже, что в примере 1, выращивают в посевной питательной среде следующего состава: глюкоза 1, 5% аммоний уксуснокислый — О, 3%, КН РО -0,1%, М (5О+ х 7Н О вЂ” 0,04%, ++ ++ ионы Fe и Ми по .0,2 мг %, биотин—

50 мкг/л, тиамин солянокислый - 200мкг/л, 45 белковый гидролизат соевых бобов (содержание азота 7%) — 15 мл/л и дрожжевой экстракт — 0,5%. Начальный рН среды 8,0.

Посевной материал выращивают при аэрировании и перемешивании среды в течение

16 час при 31оС.

15 мл посевного материала добавляют к

300 мл ферментаци онн ой среды следующего состава: глюкоза — 3%, аммоний уксуснокислый — 0,5%, мочевина — 0,2%, КН РО—

0,1%, Mg gO+x 7Н О вЂ” 0,04%, ионы Fe u

М по 0,2 мг %, биотин — 50 мкг/л, тиамин солянокислый 50 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов — 30 мл/л и те вещества, которые указаны в табл. 2. Начальный рН среды 7,5.

Выращивание осуществляют в ферментерах при перемешивании среды со скоростью

1500 об/мин и пропускании воздуха в количестве 1 об. воздуха на 1 об. среды в

1 мин. Температура 3 1, 5 оС.

В процессе ферментации рН среды поддерживают на уровне 7,2-8,0 путем автоматического добавления смеси растворов уксусной кислоты и аммония уксуснокислого в соотношении 0,25 молей аммония уксуснокислого на 1 моль уксусной кислоты, причем концентрация уксусной кислоты равна

60%; через 48 час выход I -mama солянокислого в культуральной жидкости составляет от 4,8 до 6,4 г/100 мл среды. Результаты приведены в табл. 2.

526295

Таблица 2

6,4

У-108

4,8

5,0

Пантотенат кальция

АС-73

5,7

АД-5

АД-1 62

100

6,0

Аденин

Гуанин

15 мл каждой посевной культуры добав ляют к 300 мл ферментационной среды следующего состава: глюкоза — 1,0%, этанол1,5%, (1Ч Н ) GО, — 0,5%, мочевина — 0,2%, КН РО, — 0,1%, МАЗО х 7Н О вЂ” 0,04%, ионы Fe+ и Мп цо 0,2 мг %; биотин—

50 мкг/л, тиамин солянокислый — 50 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов — 30мл/л и те вещества, которые указаны в табл. 3.

Начальный рН среды 7,5.

Таблица 3

У-108

АС-73

5,5

Пантотенат кальция

5,0

4,4

5,5

Аденин

Гуанин

АД-162

100,0

100,0

5,7

Выращивание проводят в ферментерах

45 при перемешивании среды со скоростью

1500 об/мин и пропускании воздуха в количестве 1 объем воздуха на 1 объем среды в 1 мин. Температура 31,5оС.

В процессе ферментации рН среды поддерживают на уровне 7,0-7,5 путем добавления газообразного аммиака.

Количество этанола в среде определяют с помощью газовой хроматографии и добавляют по мере надобности, когда содержа- 65 ние его в среде ниже 0.3%.

B табл. 3 приведены данные по содержанию L -лизина солянокислого в культуральной жидкости каждого штамма после

48 час ферментации. 60

Результаты по выходу, -massa после

72 час ферментации приведены в табл. 4.

Пример 3. Штаммы те же, что в примере 1, выращивают в течение 16 час на качалке при 3 1,5оС в посевной среде следующего состава; глюкоза — 1,5%, мочевина — 0,3%, КН РО,„— 0,1%, Ng 50 х _#_

+4 +Ф х7Н О вЂ” 0,04%, ионы Fe — Mn по0,2 мг%, биотин — 50 мкг/л, тиамин солянокислый—

20 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов - 15 мл/л и дрожжевой экстракт—

0,5%. Начальный рН среды 8,0. Л

Пример 4. Штаммы — продуценты:

Н еа Ъас1еиим 9псЫФе мел Ыт ЛХ—

3391 (ФЕРМ P-1570), АХ -3392 (ФЕРМ

P-1571), AT -3393 (ФЕРМ P-1572), 3394 (ФЕРМ P-1573), А7 -3395 (ФЕРМ

P-1574), A3 -3396 (ФЕРМ P-1575).

Состав среды и условия культивирования аналогичны примеру 1 за тем исключе нием, что добавляют белковый гидролизат соевых бобов в количествах, указанных в табл. 4, а в среду для штамма AJ -3396 добавляют 50 мл/л гипоксантина.

526295

Таблица 4

3,0

2,9

1,5

5,0

1,5

4,6

3,0

3,5

2,0

3,1. 3,0

3,0

Таблица 5

5,4

7,1

7,0

6,5

5,8

6,1

50,0

Таблица 6

5,2

6,3

6,3

6,1

5,0

5,5

50,0

AJ -3391

Aj -3392

AJ -3393

AJ -3394

AJ -3395

АУ -3396

Пример 5. Штаммы — продуценты те же, что в примере 4.

Ферментацию проводят с использованием в качестве основного источника углерода уксусной кислоты так, как это описано в

А3 -3391

AJ -3392

А3 -3393

A3 -3394

АУ -3395

AJ -3396

Пример 6. Штаммы — продуценты те же, что в примере 4.

Ферментацию проводят с использованием в качестве основного источника углерода этанола, как это описано в примере 3, за

АХ -3391

A3 -3392

AJ -3393

АХ -3394

А3 -3395

А3 -3396 примере 2 за тем исключением, что в среду для штамма А3 -3396 добавляют 50мг/л гипоксантина.

Данные по количеству 4 -лизина солянокислого через 48 час ферментации приведены в табл. 5. щ тем исключением, что в среду для штамма

AJ -3396 добавляют 50 мг/л гипоксантина.

Данные по выходу лизина через 48 час ферментации представлены в табл. 6.

526295

Количество полученного Выход, % от испольлизина, г/100 мл среды зованной глюкозы

Штамм

А3 — 3424

АХ -3425 № 872

4,4

3,2

1,8

22

7,2

А3 -3424

Aj -3425

¹ 872

6,1

4,0

Для штаммов AI -3392 и AJ -3393 вы ход лизина 6,3 г/100 мл среды, что составляет 27,7% относительно использованного этанола.

Пример 7. Штаммы — продуценты:

Вму ЬаС еиов Всего(е щеи и э AJ—

3424 (ФЕРМ P-1711), AJ -3425 (ФЕРМ

P-1712) и № 872 (контроль). Состав среды и условие культивирования аналогичны

При мер 8. Штаммытеже, чтов примере 7, выращивают в течение 18 час на качалке при 31оС на посевной среде следующего состава: глюкоза — 1,5%, аммоний уксуснокислый — 0,3%, мочевина—

0 1%, КН РО - 0,1%, Ng ВО 7Н О

Ф+ ++

0,04%, ионы Fe и Мп по 0,2 мг %, биотин — 50 мкг/л, тиамин солянокислый—

200 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов (содержание азота 7%) — 2%. Начальный рН среды 7,5. Состав ферментационной среды: глюкоза — 2%, аммоний уксуснокислый — 0,5%, мочевина — .0,2%, КН РО+ — О, 1%, Ng ЯО х 7Н О вЂ” 0,04%, ++ ++ ионы Fe и МИ цо 0,2 мг %, биотин—

50 мкг/л, тиамин солянокислый — 50 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов (общий азот 7%) — 2,5%. Начальный рН среды 7,5.

После стерилизации к 300 мл ферменПр и мер 9. Штаммытеже, чтов примере 7.

Посевной материал выращивают в среде такого же состава, как описано в примере

8, но вместо уксуснокислого аммония добавляют 0,5% этанола и 0,3% мочевины.

Выращивание осуществляют в течение

18 час при температуре 31оС в условиях аэрирования. примеру 1 за тем исключением, что в среду добавляют 200 мкг/л тиамина солянокислого, а в среду для штамма АХ -3425 дополнительно добавляют 3% белкового гидролизата соевых бобов.

Данные по выходу L -лизина солянокислого через 72 час ферментации представлены в табл. 7i

Таблица 7

2О тационной среды добавляют 15 мл посевного материала.

Ферментацию ведут в стеклянных ферментерах общим объемом 1 л при перемешивании со скоростью 1500 об/мин и про пускании воздуха со скоростью 1 объем воздуха в расчете на 1 объем среды в

1 мин. Температура 31-33оС.

B процессе ферментации рН среды поддерживают автоматически на уровне 7,28,0 путем добавления смеси растворов уксусной кислоты и аммония уксуснокислого в следующем соотношении: 0,25 молей уксуснокислого аммония на 1 моль уксусной кислоты. Концентрация уксусной кислоты

60%.

Данные по выходу L -ammu салянокислого через 55 час ферментации представлены в табл. 8.

Таблица 8 фермептацию ведут аналогично примеру

8, но в ферментациониую среду вместо ук суснокислого аммония добаигщют 1% глюк<ьЭ зы, 1% этанола и 0,5% серж ивсааго аммония

B процессе ферментации рН среды поддерживают as уровне 7,2-8,2 путем добав ления газообразного аммиака. фр Количество этанола в среде определяют

526295

Таблица 9

А3 -3424

Aj -3425 № 872

6,6

5,6

3,6

Пример 10. Штамм Brevibgcie iue

Ьс1ойииаиМю А3 -3429 (ФЕРМ P1857). Посевной материал выращивают в бульоне. Готовят ферментационную среду следующего состава: глюкоза — 10%, (N Н ) 804 4,5%, КН РОд — 0>1%, Ng ЯО х 7Н О вЂ” 0,04%, ионы Fe u N n по 0,2 мг% сд биотин — 50 мкг/л, тиамин солянокислый200 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов (общий азот 7% ) — 1%, СаСΠ— 50/о.

Начальный рН среды 7,0.

Среду разливают по 20 мл в качалочные колбы объемом 500 мл и стерилизуют

5 мин при 110оС.

Ферментацию проводят в течение 72 час на качалке при 31оС.

Выход L -лизина солянокислого составТаблица 10

2,0

А -3397

А3 -3458

А3 -3460

А3 -3461

А3 -3464

AJ -3465

3,0

4,1

3,1

2,9

3,2 экстракта, а рН среды поддерживают на уровне 7,0.

В ферментационную среду, кроме того, добавляют 2,5% белкового гидролизата соевых бобов.

Результаты по выходу (, -лизина после бр 55 час ферментации представлены в табл ll, с помощью газовой хроматографии и производят добавку этанола, когда его содержание в среде становится ниже 0,3%.

Пример 12. Штаммы — продуценты как в примере 11.

Условия ферментации аналогичны примеру 2 с использованием в качестве основного источника углерода уксусной кислоты за тем исключением, что в питательную среду дополнительно добавляют 0,5% дрожжевого

Данные по выходу ь -лизина солянокислого после 48 час ферментации приведены в табл. 9. ляет 5, 1 г/100 мл среды (5 1% выхода в расчете на потребленную глюкозу).

Пример 11. Штаммы — продуценты:

0оииеЬас1еиии g3u4qvicum AJ -3397 (ФЕРМ P-1613), Aj -3458 (ФЕРМ P—

1982), АХ -3460 (ФЕРМ P-1984), AJ—

3461 (ФЕРМ Р-1985), gorynebaa

В ийч АХ -3464 (ФЕРМ Р-2026) и

1о меЬасЫ и п асе оасiдорЬ Iu e AJ—

3465 (ФЕРМ P-2027).

Состав сред и условия культивирования аналогичны примеру 10 за исключением того, что в среду для штамма A3 -3460 дополнительно вводят 0,5% дрожжевого экстракта.

Данные по выходу -лизина после

72 час ферментации представлены в табл.10.

526295

Таблица 11

Получено .4 -лизина, г/100 мл среды

Расход уксусной кислоты, %

Штаммы

5,0

AJ -3397

А3 -3458

АЗ -3460

A3 -3461

А3 -3464

AJ -3465

5,2

23,5

4,7

6,4

5,5

5,8

0,2 мг %, биотин — 50 мкг/л, тиамин солянокислый — 50 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов (общий азот 7%) — 2,5%.

Начальный рН 7,5.

После стерилизации 300 мл ферментационной среды засевают 15 мл посевного материала. Ферментацию ведут в стеклянных ферментерах объемом 1 л при температуре

31-33оС, перемешивании и продувании 1 объема воздуха в расчете на 1 объем среды в 1 мин.

В процессе ферментации рН среды поддерживают на уровне 7,2-7,8 путем добвления газообразного аммиака.

Количество этанола определяют с помощью газовой хроматографии и добавляют его при падении уровня этанола в среде ниже 0,3%.

Данные по выходу Ь -лизина после

48 час ферментации представлены в табл 12.

Таблица 12

4,8

А -3397

AJ -3464

А3 -3465

20,5

4,1

24,0

4,6

1. Способ получения L -лизина путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов, относящихся к одному из родов

В МЪас1еииж, Сом иеЬасЛеиию устойчивых к аналогам лизина, в питательной сре- 55 це, содержащей усваиваемые источники углерода и азота, неорганические соли и органические вещества, стимулирующие рост, при рН от 5 до 9, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения процесса бв

Пример 13. Штаммы — продуценты:

L,or > пеЪас1еии и ф1и1а я съ ж А3 -3397 (ФЕРМ P-1613), Corsrrebac(eriurrr 3B u rrr

АХ -3464 (ФЕРМ Р-2026, Corvneh cherium асе1оас дорй ив AJ -3465 (ФЕРМ 20

P-2027) .

Состав посевной среды: глюкоза — 1,5%, мочевина — 0,3%, КН РОф Оу 1%, М О4 х х7Н О вЂ” 0,04%, ионы ГЕ и Ми лоб,2мг%, биотйн — 50 мкг/л, тиамин солянокислый — Ж

200 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов (общий азот 7%) — 1,5%. Начальный рН 7,0.

Посевной материал выращивают в течение 18 час при 31оС при перемешивании ЗО и аэрации.

С остав ферм ентаци онн ой среды: глюкоза

1%, этанол — 1%, (N Н ) О4,— 0,5%, мочеBHHG — 0,2%, КНеРΠ— О, 1%. М ЯО х 7Н О вЂ” 0,04%, ионы Fe u Nrr no 35

Формула изобретения и повышения выхода продукта, из родов3. енЫАеииа и СоилеЬас еи urrr используют один из мутантных штаммов, обладгиощих наряду с устойчивостью к аналогам лизина потребностью по крайней мере в одном соединении, выбранном из группы, содержащей серии, пролин, алании, никотинамид, пантотеновую кислоту, тиамин, гуанин, гипоксан тин и витамин В„, а именно, из рода ВгеЙЬайеиил используют вид В.вас1о1е мепЫ и, штамм У-108 АТСС 21798, АС-73 АТСС 21799, АД-5 АТСС 21800»

526295

Составитель Л. Минеева

Редактор А. Бер Техред А. Богдан Корректор С. Шекмар

Заказ 5044/476 Тираж 575 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП " Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, АД-162 АТСС 21801, AJ -3424 ФЕРМ

P-1711, AJ -3425 ФЕРМ P-1712, AJ—

3429 ФЕРМ P-1857, A3 -3391 ФЕРМ

P-1570, А1 -3394 ФЕРМ P-1573, Aj—

3395 ФЕРМ P-1574, А3 -3396 ФЕРМ ь

P-1575, AJ -3392 ФЕРМ P-1571 или

AJ -3393 ФЕРМ P-1572, из рода Согчпеbacter m используют вид С.gLuha m cwm штамм АУ -3397 ФЕРМ P-1613, AJ—

3458 ФЕРМ P-1982, AJ -3460 ФЕРМ )p

Р-1984 или А3 -3461 ФЕРМ P-1985, вид С. <)sum rrrraMM AJ -3464 ФЕРМ

P-2026, видС.acehoacidoph4 Iud, штамм

AT -3465 ФЕРМ P-2027.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю — l5 шийся тем, что в качестве ассимилируемого источника углерода применяют углеводы.

3. Способ по и. 1, о т л и ч а ю— ш и и с я тем, что источником ассимили- 20 руемого углерода является уксусная кислота.

4. Способ по и. 1, о т л и ч а ю— шийся тем, что источником ассимилируемог о углер ода является этан ол. Л

5. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что аналогом 1 -лизина является S -(2-аминоэтил)-, -цистеин.

6.Способпоп. 1, отл ичаюшийся тем, что в качестве необходимых для роста веществ применяют природные вещества.

Приоритет по и. 1 по признакам:

27.04.72 -Breve 1.ас1о1еииеи1о и У-108

АТСС 21798;Вгеч Lackofermenku m АС-73

АТСС 21799; Вгеч» Lachoferme tum АД-5

АТСС 21800;Вгеи Lactofermentum АД162 АТСС 21801;

18.08.72 — Вгеч Lactofermenium

АХ -3391 ФЕРМ Р-1570;Вгеи Lactofer

medium AT -3392 ФЕРМ P-1571 Вгеч

1.ас1о1егrnentum AJ -3393 ФЕРМ P1572;Вгeч ас оГегмеи1ам AT -3394

ФЕРМ P-1573:Вгеа Lactofermevkum

А3 -3395 ФЕРМ Р-1574; Breve Lactofcrme u w A3 — 3 3 96 ФЕРМ Р-1 5 75;

19.09.72 Согчие Ы1ав сию АУ—

3397 ФЕРМ P-1613;

30.11.72 -Вгеч 4ас1о1егтеЫит

AT -3425 ФЕРМ P-1 712; Brey Lackof ermentum AJ -3424 ФЕРМ P-1711.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент ФРГ № 2034406, кл. 6в16/03.