Способ получения продуктов ферментативных реакций

Способ получения продуктов ферментативных реакций

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А Н И Е (1ц 526623

ИЗОБРЕТЕНИЯ

bows ооветсккк

Социалнстнческкк

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 31.07.74 (21) 2059367, 04 с присоединением заявки ¹

ГосударстеенныЙ комнтет (23) П риоритет

Совета Министров СССР по делам изобретений Опубликовано 30.08,76 Бюллетень № 32

Pl) М. Кл С 076 7/02 (53) УДК 577.15.07 (088.8) н открытий

Дата опубликования описания 13.10.76 (72) Авторы изобретения П. И, Гвоздяк, Н. Ф. Могилевич, 3. М. Побережец и P. И Гвоздяк (71) Заявитель Институт коллоидной химии и химии воды АН Украинской ССР (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ П РОДУКТОВ ФЕРМ Е НТАТИ В Н ЫХ

РЕАКЦИЙ

Изобретение относится к области биохимической технологии и представляет собой усовершенствованный способ получения продуктов ферментативных реакций в биохимических реакторах.

Предлагаемый способ может быть использован на предприятиях пищевой, медицинской и микробиологической промышленности а также при очистке сточных вод на промышленных предприятиях.

В современной биохимической технологии находят все более широкое применение ферментативные процессы. В последнее время для их осуществления используют иммобилизованные ферменты.

Известные до настоящего времени способы получения препаратов иммобилизованных ферментов предусматривают предварительное получение закрепленных на носителе или в порах носителя ферментов, которое часто сопровождается заметным снижением активности закрепленных ферментов, требует проведения трудоемких технологических операций, очищенных ферментов, дорогих и дефицитных реактивов, используемых для связывания ферментов.

Известный способ предусматривает проведение ферментативных реакций путем контактирования ферментов с нерастворимым в воде и не вызывающим денатурации белка носителем и пропускание через эту систему раствора или суспензии субстрата, причем в качестве носителя используют полимеры -- полиэтилен, поликапролактам, полиуретан и дру5 гие, поверхность которых предварительно обрабатывают химическими реагентами, содержащими нитрильные, амидные илп уреидные группы, способствующие адсорбцпн фермента.

Недостатками известного способа проведе10 ния ферментативных реакций являются: недостаточно высокая интенсивность ферментивных реакций из-за незначительной адсорбционной емкости носителя; загрязнение конечного продукта реакции вы15 носимыми из носителя ферментами и продуктами обмена развивающихся в реакторе микроорганизмов, так как ферментатпвные реакции проходят при температурных оптимальных для развития многих микроорганизмов, а

2,) ферменты — белки представляют собой отличную питательную среду для нпх; ограниченный арсенал носителей, который вкспочает в себя только лишь некоторые полимеры (полиэтилен, поликапролактам, по25 лиуретан), которые, к тому же, требуют специальной подготовки поверхности химическими реактивами, способствующими адсорбцпп фермента.

Предлагаемый способ проведения ферменЗо тативных реакций проведения позволяет рас526623 ширить ассортимент носителей, а также способствует интенсификации процесса ферментации и улучшения качества конечных продуктов и заключается в том, что операции контактирования ферментов с носителем и пропускания через эту систему раствора или суспензии субстракта осуществляют в электрическом поле постоянного тока напряженностью 5 — 300 в/см.

Контактирование ферментсодержащего препарата с носителем в электрическом поле приводит к повышенной и регулируемой напряженностью электрического поля сорбции фермента на носителе. При этом количество адсорбированного фермента может в сотни и тысячи раз превышать адсорбционную емкость носителя по ферменту вне электрического поля. Это обеспечивает интенсификацию процесса ферментации, позволяет увеличить скорость пропускания субстрата. Количество адсорбированного фермента и прочность удерживания его носителем можно регулировать с помощью напряженности электрического поля. Каталитическая активность фермента в электрическом поле не уменьшается. Установлено также, что наложение электрического поля на заполненный носителем обьем подавляет развитие в этом объеме микроорганизмов и даже действует бактерицидно. Предотвращение размножения микроорганизмов в объеме загрузки исключает снижение интенсивности ферментативного процесса за счет потребления микроорганизмами белков-ферментов в качестве источников питания. Использование неорганических материалов в качестве носителя также устраняет возможность их микробного разрушения. Все это предотвращает загрязнение конечного продукта микробными метаболитами.

В отличие от известного способа, в котором в качестве носителя ферментов используются синтетические полимеры вполне определенного строения, по предлагаемому способу носителем ферментов может служить любой зернистый, волокнистый и (или) пористый материал, не вызывающий денатурации фермента — белка, выбранный из группы диэлектриков, например силикагель, песок, глинистые материалы, природные и синтетические полимеры, и проводников II рода, например, ионообменные смолы.

Для проведения ферментативной реакции по предлагаемому способу можно пользоваться ферментными препаратами различной степени очистки — от кристаллических до технических, что значительно расширяет возможности осуществления таких реакций, делает их дешевыми и доступными. Стоимость предлагаемого способа проведения ферментативных реакций выразится в расходе электроэнергии, который в случае проведения реакции в обессоленной воде крайне незначителен.

При использовании низких напряженностей электрического поля (меньше 10 в/см) 5

2з

2> з

55 бО

65 снижается степень удерживания фермента в объеме загрузки, а при высоких напряженностях (более 300 в/см) может происходить существенное нагревание загрузки, что ведет к денатурации белка и потере ферментативной активности.

При необходимости ферментные процессы могут быть прерваны на некоторое время, например на ночь, выходные дни, прекращением подачи субстрата и выключением электрического тока. Для возобновления ферментации включают ток и обеспечивают подачу субстрата.

Ферментативная реакция по предлагаемому способу может быть осуществлена в простом аппарате, изготовление которого не представляет трудности для любого предприятия.

Использование предлагаемого способа проведения ферментативных реакций имеет по сравнению с известными способами следующие преимущества: увеличение скорости ферментативных реакций за счет увеличения количества адсорбированного на носителе фермента; использование самых разнообразных материалов в качестве носителей без предварительной обработки их поверхности; получение конечных продуктов ферментативной реакции высокого качества, без примесей белков и продуктов обмена микроорганизмов; применение иммобилизации и проведения ферментативных реакций не только высокоочищенных, кристаллических ферментов, но и технических ферментативных препаратов.

Пример 1. В среднюю камеру трехкамерной ячейки размером 25)(37 мм (длина — ширина — высота) загружают носитель-вату — и отделяют от электродных камер целлофановыми мембранами. Электродные камеры заполняют активированным углем и обеспечивают проток дистиллированной воды.

Через среднюю камеру при наложенном электрическом поле (напряженность 200 в/см) пропускают раствор кристаллической бактериальной амилазы (производство японской фирмы «Daiwa Kasei К. К.») со скоростью 12 мл/мин. При этом амилаза закрепляется на носителе — вате. Затем через загрузку с носителем и сконцентрированным на нем таким образом ферментом пропускают

1% -ный раствор крахмала со скоростью

1,2 мл/мин. Из загрузки вытекает раствор, содержащий глюкозу.

Одной загрузкой фермента можно осуществлять гидролиз (даже с перерывами в ночные смены и выходные дни) в течение нескольких недель.

Спектрофотометрический анализ, вытекающий после ферментативного процесса жидкости, указывает на отсутствие в ней фермента.

Пример 2. Силикагель марки КСМ-5 загружают в среднюю камеру ячейки, описанной в примере 1, и пропускают через эту загрузку

526623

Составитель А. Бочаров

Редактор Т. Никольская

Текред А. Камышникова

Корректор А, Дзесова

Заказ 1827!/1 Изд. № 1554 Тираж 575 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

1,5 /о-ный водный раствор очищенного амилолитического препарата из гриба Aspergillus огу1ае 47б и при напряженности электрического поля постоянного тока 150 в/см со скоростью 0,9 мл/мин. Через среднюю камеру при включенном электрическом поле пропускают 0,1 /о-ный раствор глюкофрангулина с такой же скоростью протока.

Бумажнохроматографический анализ — (система бутанол — уксусная кислота — вода

4: 1: 5) вытекающей из камеры жидкости указывает на наличие в ней продукта ферментативной реакции — франгулина и отсутствие исходного глюкофрангулина. Белок в вытекающсй жидкости не обнаруживается с помощью ультрафиолетового спектрсфотометра

«Specord VV VlS».

Пример 3. Через среднюю камеру ячейки, описанной в примере 1 и загруженной смесью анионообменной (АБ-17) и катинообменной (КУ-2) смол (в соотношении 1,4: 1) при включенном электрическом поле напряженностью 10 в/см пропускают 0,7% ный водный раствор грибной целлюлазы, а потом

0,1% -ный раствор карбоксиметилцеллюлозы со скоростью 0,2 мл/мин. В вытекающем из загрузки растворе с помощью химических реакций обнаруживается глюкоза: фермент из загрузки не вымывается.

Пример 4. Через среднюю камеру ячейки, списанной в примере 1 и загруженной 750 г ваты, при наложенном электрическом поле напряженностью 50 в/см пропускают 1,5%-ный водный раствор очищенного ферментатного препарата «Ораза» из гриба Aspergillus orysae 47б И, а затем 0,05 /о-ный раствор стероидного сердечного глюкозида к-строфантин-P со скоростью 0,1 мл/мин. Хроматографический анализ вытекающей жидкости показывает наличие в ней сердечного глюкозида цимарина, что свидетельствует о ферментативной трансформации исходного продукта. Спект5 рофотометрически подтверждается отсутствие фермента в вытекающей жидкости.

Пример 5. Среднюю камеру трехкамерной ячейки, описанной в примере 1, размером

50+8+115 мм (длина — ширина — высота)

10 загружают отмытым песком и прп включенном электрическом поле напряженностью

200 в/см пропускают 1%-ный водный раствор очищенного а мил олитического ферментного препарата из гриба Aspergillus orysae 476 И, 15 а затем 1%-ный раствор крахмала со скоростью 1,0 мл/мин. В вытекающей из =-агрузки жидкости содержится глюкоза.

Формула изобретения

20 1. Способ получения продуктов ферментативных реакций, включающий контактирование ферментов с нерастворимым в воде и не вызывающим денатурации белка носителем и пропускание через эту систему раствора или

25 суспензии субстрата, отличающийся тем, что, с целью интенсификации процесса ферментации и улучшения качества конечного продукта, контактирование ферментов с носителем и пропускание через эту систему раст30 вора или суспензии субстрата осуществляют в электрическом поле.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс ведут в электрическом поле постоянного тока напряженностью 5 — 300 в/см.

35 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве носителя применяют природный или синтетический полимер, например вату.