Штамм n 806-продуцент 2 кетогулоной кислоты

Штамм n 806-продуцент 2 кетогулоной кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

N АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

О всю веаетских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 24.01.75 (21) 2099177/13 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

Опубликовано 30.08.76 Бюллетень № 32

Дата опубликования описания 13.10.76!

02

13/06

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения

Р. М. Алиева и М. Х. Шигаева

Институт микробиологии и вирусологии АН Казахской ССР (71) Заявитель (54) 111 TAMM PSEUDOMONAS FLVORESCENS № 806 — ПРОДУЦЕНТ 2-КЕТО-1-ГУЛОНОВОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового штамма — продуцента 2-кета-l-гулоновой кислоты, используемой при биологическом получении аскорбиновой кислоты в медицинской и пищевой промышленности.

Известный штамм Pseudomonas fluorescens

С-4 характеризуется едва заметным ростом на средах с сорбозой в качестве единственного источника углеродного питания в отличие от остальных видов, у которых рост отсутствует полностью.

Новый мутантный штамм Pseudomonas fluorescens ¹ 806 получен при ступенчатом воздействии УФ-лучей и двух супермутагенов типа N-метил-нитрозо-N-нитрозогуанилина и

N-нитро-N-метилбиурета.

В результате проведенного воздействия отобран мутант Pseudomonas flurescens ¹ 806, который характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки, Клетки прямые, палочковидные, мелкие, размеры 0,4 — 1,5 мк. Подвижные, встречаются в виде одиночных, чаще в виде коротких цепочек. Перитрихи, грамотрицательные. Спор не образуют.

Мясопептонный агар. Кремовые колонии, округлые, гладкие с ровными краями. Колонии легко снимаются петлей. Пигмента не образуют.

Картофель и морковь. Рост неинтенсивный, образуют слабый налет бежевого цвета.

5 Физиологические свойства.

Аэроб, максимум роста прп температуре от

28 до 35 С.

Молоко интенсивно пептонизирует на пятые сутки с образованием сгустка желтого цвета.

1о 5Келатину разжижает умеренно, окончательного разжижения не наблюдается, Крахмал слабо гидролизует. Клетчатку не гидролизует.

Сорбоза, глюкоза, галактоза интенсивно

15 усваиваются, причем глюкоза по сравнению с исходным штаммом усваивается слабее.

Левулеза, арабиноза, мальтоза, лактоза, сахароза, фруктоза, декстрпн, глицерин, маннит и дульцит не используются.

2о Нитраты восстанавливает на двенадцатые сутки.

Культуры штаммов — исходного Pseudomonas fluorescens С-4 и мутантного Pseudomonas fluorescens ¹ 806 — хранятся в коллекц|ш

23 института микробиологии и вирусологии

АН Казахской CCP.

Штамм Pseudomonas fluorescens ¹ 806 является продуцентом 2-кето-l-гулоновой кислоты и осуществляет непосредственное окислеЗэ ние сорбозы в 2-кето-l-гулоновую кис526660

30

40

6О

3 лоту на среде с 10 /о-ной сорбозой и органическими компонентами в виде дрожжевого автолизата и гидролизата казеина при рН среды7,6, t=28 — 30" С, обеспечивая выход продукта в количестве от 2,85 до 3,8 r на 100 мл среды.

Пример 1. а) Получение посевного материала.

10 мл питательной среды, содержащей, . /о. сорбозу 1,0, аспарагин 1,0; КН РО4 0,5, MgSO4 0,1, FeSO4 0,1, разливают в качалочные колбы по 100 мл, стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин и засевают Pseudomonas fiuorescens K 806, предварительно выращенным на скошенном arape, из расчета 1 пробирка на 2 колбы. Рост посевного материала ведется при 28 С в течение 24 час на качалке, дающей 180 об/мин. б) Ферментация.

10 л среды, содержащей, %: сорбозу 10,0, глицерин 0,5, кукурузный экстракт 3,0, MgSO4 0,01; FeSO4 0,01; КН РО4 0,2, NaC1

0,2, воду дистиллированную 1 л (pH среды

7,5),разливают в 100 качалочных колб, стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. В охлажденную среду вносят посевной материал в количестве 10 /о. Колбы ставят на качалку при 180 об/мин. Ферментация продолжается

48 час. при 28 С, причем через каждые 6 час определяется 2-кето-1-гулоновая кислота методом бумажной хроматографии. в) Определение содержания 2-кето-l-гулоновой кислоты методом бумажной хроматографии в системе: этилацетат, уксусная кислота, вода — 11: 2: 2. Восходящую хроматограмму обрабатывают О-фенилендиамидом.

При изучении ее в УФ-свете обнаруживают желтое светящееся пятно, которое представляет собой 2-кето-l-гулоновую кислоту. г) Химическое выделение 2-кето-l-гулоновой кислоты по методу Matusaka 1953, Preparation of Vitamin С ву fermentation, J. Fermentation

Fech. Japan, 31, 39 — 42.

С помощью центрифугирования отделяют культуральную жидкость от бактерий. В культуральную жидкость добавляют 3 г сульфида свинца и нагревают до 40 С, после чего оставляют на ночь. На следующий день над поверхностью раствора пропускают пары сероводорода, очищают, удалив сульфид свинца. Определяют количество Са++ в фильтрате добавлением 5 /о щавелевой кислоты. Раствор подогревают и пропускают через ионообменную смолу JR-120, полностью удалив излишки Са++. Затем сгущают под пониженным давлением и получают сиропоподобный раствор. Водный раствор продукта в концентрации 1 r на 100 мл дает угол оптического вращения — 24,4 . В сиропообразную жидкость добавляют кристаллик чистой 2-кето-1-гулоновой кислоты, ставят в холодильник и через

24 часполучают выкристализовавшуюся 2-кето-1-гулоновую кислоту.

Пример 2. 10 л ферментационной среды засевают 10 -ным посевным материалом

Pseudomonas f1uorescens М 806, как описано в примере 1. Колбы ставят на качалку и ферментация продолжается в течение 48 час. Образование 2-кето-l-гулоновой кислоты наблюдается уже в первые часы ферментации (через 6 час). Однако наибольшее ее количество наблюдается к 48 час ферментации. К этому времени 2-кето-l-гулоновой кислоты в кристаллическом виде накапливается до 4,6 г.

Пример 3. 10 л ферментационной среды следующего состава, /о. сорбоза 10,0, КН РО4

0,2, К НРО4 0,7, MgSO4 0,01, (NH4) $04 0>1, натрий лимоннокислый 5Н О 0,05, рН вЂ” 7, засевают 10 /о -ным посевным материалом культуры Pseudomonas fluorescens № 806.

Колбы ставят на качалку. Ферментация продолжается в течение 48 час. Образование 2кето-1-гулоновой кислоты наблюдается уже через 6 час ферментации. К этому времени 2кето-l-гулоновой кислоты в кристаллическом виде накапливается до 3,2 г.

Допустимые пределы концентраций ингредиентов питательных сред, о/о а) Среда для выращивания посевного материала.

Сорбоза 1,0 — 2,0

Аспарагин 1,0 в 1,5

КН2Р04 0,2 — 0,5

МДЬО4 0,01 — 0,1

FeSO4 0,01 — 0,1

o) Ферментационная среда.

Сорбоза 10,0 — 15,0

Глицерин 0,5 в 1,0

Кукурузный экстракт 3,0 — 5,0

MgSO4 0,01 — 0,1

FeSO4 0,01 — 0,1

КН,РО4 0,2 — 0,5

NaC1 0,2 — 0,5

Вода дистиллированная, л 1 рН=7,5

Формула изобретения

Штамм Pseudomonas fluorescens ¹ 806— продуцент 2-кето-1-гулоновой кислоты хранится в коллекции Института микробиологии и вирусологии АН Казахской CCP.

Морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидные, мелкие, размером 0,4 — 1,5 мк. Подвижные, встречаются в виде одиночных, чаще в виде коротких цепочек.

Споры не образуют.

Рост на средах.

Мясо-пептонный агар. Колонии кремового цвета, округлые, гладкие с ровными краями, легко снимаются петлей, Пигмента не образуют.

Картофель и морковь. Рост неинтенсивный, образуют слабый налет бежевого цвета.

Физиологические свойства.

Молоко. Интенсивно пептонизирует на пятые сутки с образованием сгустка желтого цвета. желатина. Разжижает умеренно, окончательного разжижения не наблюдается.

Крахмал. Слабо гидролизует.

526660

Составитель М, Ларина

Техред А. Камышникова

Корректор А. Дзесова

Редактор М. Дмитриева

Заказ 1827/5 Изд. № 1554 Тираж 575 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений п открытий

113035, Москва, 7К-35, Раушская наб., д. 4 5

Типография, пр. Сапунова, 2

Клетчатка. Не гидролизует.

Сорбоза, глюкоза, галактоза интенсивно усваиваются.

Левулеза, арабиноза, мальтоза, лактоза, сахароза, фруктоза, декстрин, глицерин, маннит и дульцит не используются, Нитраты. Восстанавливает на двенадцатые сутки.

Максимум роста достигается при температу5 ре от 28 до 35 С, аэроб.