Способ получения антибиотиков

Способ получения антибиотиков

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 528038 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 27.03. 75 (21) 2123702/13 (23) Приоритет — (32) 28.03. 74 (31) 1 38 56/74 (33) Великобритания (43) Опубликовано05.09.76.Бюллетень № 33 (45) Дата опубликования описаиия14.06.77 (51) M. Кл.

С 12 Q 9/00

Государственный комитет

Совета Министров СССР ао делам ивооретений и открытий (53) УДК 615.779.9 (088.8 ) И н остр а нцы

Мартин Коул, Джон Дик Худ и Деннис Баттерворд (Великобритания) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Бичам Груп Лимите д" (Великобритания) (71) Заявитель (54 ) СПОСОБ ПОЛУ ЧЕН1И АНТИБИОТИКОВ

Изобретение относится к.микробиологии, а именно к получению антибиотиков.

Способ получения антибиотика ММ 13902 ,или его солей заключается в том, что штамм

Й1 eptomyce9 o/

Штамм, используемый для получения антибиотика, был получен путем мутатенной обработки Dt s. о6насеиб АТСС 21379 и хра нится в Американской коллекции культур под15 номером АТСС 31126.

Культурально-морфологические признаки.

11епи зрелых спор обычно ьывают длинными, цепь содержит свыше 50 спор. По- 20 верхность спор гладкая.

На среде 1 5 P ¹ 4 — воздушный мицелий серый/коричневый, субстратный мицелий оливково-коричневый, pecTBoplpëûé пигмент отсутствует. Спорофоры длинные. 25

На среде Д S P № 2 - воздушный мицелий серый/коричневый, субстратный мицелий оливково-коричневый. Растворимый пигмент отсутствует . Спорофоры длинные.

На среде т 6P № 5 — воздушный мицелий серый, субстратный мицелий коричневый, растворимый пигмент отсутствует. Спорофоры длинные.

На среде 36 Р № 3 — воздушный мице лий серый, субстратный мицелий оливковокоричневый, спорофоры длинные. Растворимый пигмент отсутствует.

Штамм усваивает рамнозу, инозит, глю козу, ксилозу, фруктозу, маннит, арабинозу; не усваивает раффинозу, сахарозу.

Культивирование gkv. oui va ceufs осуществляют при температуре 28+2оС в аэробных условиях как на твердой или полужидкой питательной среде, так и в водной питательной среде, в которой растворены или суспендированы питательные вещества. Наиболее приемлемой является среда, содержащая сложные питательные вещества, такие как экстракт дрожжей, муку из соевых бобов и т.д. Прибавление ионов кобальта, 528038

3 ионов сулн ата и карбоната кальция оказывает благоприятное влияние.

В процессе ферментации и выделения антибиотика проводят биологические анали« зы с применением штамма КРеЬс еИа— ае ogerreS .(проба КАЯ).

Нелевой продукт получают иэ фильтрата культуры, Все этапы выделения и очистки антибиотика должны протекать при темпера туре не выше 12©С. <о

Для разделения антибиотического комплекса можно применять различные известные . способы. Наиболее целесообразной после дова тельностью стадий является адсорбция на угле, экстракция с переносчиком, хромато- 15 графия на целлюлозе.

Пример 1. Получение ММ 4550 (комплекс).

8tvepto yce9 оЬчасеи& АТСС 31126.. выращивают в течение 7 суток при темпера-Ь) туре 28 С в колбе Ру на поверхности тверо дой агар-агаровой среды следующего состава (в г/л):

Дрожжевой экстракт 10,0

Моногидрат глюкозы 10,0

Агар-агар 15,0

Вода водопроводная, л l1o 1 рН среды до стерилизации 6,8.

50 мл стерильной деионизированной воды, содержащей 0,02% "Твин 80", прили» вают к культуре в колбе Ру, и споры суспендируют встряхиванием. Полученную суспензию микроорганизмов прибавляют для вызревания к 75 л стерилизованной среды в бро-, дильном чане емкостью 100 л. 85

Состав ферментационной среды (в г/л):

Мука из соевых бобов 10,0

Моногидрат глюкозы 20,0

Водопроводная вода, л До 1

Для предотвращения вспенивания в ферментационную среду до стерилизации добавляют 50 мл 10%-ного Плуроника Ь81" в соевом масле.

Среду стерилизуют водяным паром и бро- © дильном ча в в течение 20 мин при температуре 120 С. Культуральную жидкость перемешивают со скоростью 340 об/Мин и скоростью аэрации 150 л/мин, Инкубирование осуществляют при температуре 28оС в течение 45 час.

7,5 л полученной культуры вносят в

150 л стерильной среды в бродильном чане емкостью 300 л.

Состав ферментационной среды (в r/ë); И

Соевая мука l0,0

Моногидрат глюкозы 20,0

Мел 0,2

Хлористый кобальт 0,001

Вода водопроводная, л До 1 60

Для предотвращения вспенивания добавляют 300 мл 10%-ного "Плуроника Ь 81 в соевом масле. Продукт ферментации собирают через 48 час и осветляют центрифугированием.

100 л осветленного раствора перемешивают с 12 кг ионообменной целлюлозы Вач ман llE 32 в ацетатной форме.

Шлам фильтруют, и комплекс ММ 4550 элюируют с целлюлозы 12 л 0,5 М раствора сульфата калия. Экстракт концентрируют до 6 л в выпарном пленочном аппарате в вакууме при температуре ниже 30 С. Суль фат калия осаждают 12 л ацетона, Раствор фильтруют и концентрируют до обьема 200мл вьгпариванием в вакууме при температуре ниже 30 С. Концентрат загружают в коо лонку (76 мм х 2 м), заполненную смолой

Амберлит ХАД-1, и элюируют деионизированной водой, собирая элюат фракциями по

140 мл.

Активные фракции собирают вместе (2,2 л) и концентрируют до 275 мл путем ультрафильтрования через мембраны Амикон

Ч М - 0,5 (4 =150 мм) под давлением и азота 420 и/м . Концентрат высушивают вымораживанием, получают 2,2 г коричневого порошка (j 0,004 мкг/мл). бо

1 г порошка растворяют в 1 л 0,2 М раствора сульфата натрия и смешивают с

1 л 2%-ного (вес/обьем) раствора кислого сульфата тетра-н-бутиламмония в ди- хлорметане. Дихлорметановую фазу отделяют по весу, охлаждают до температуры- 70 С,, о фильтруют для удаления льда и концентрируют выпариванием до 20 мл.

К концентрату прибавляют 400 мл петролейного эфира с т.кип. 40-60 С, и осадок собирают фильтрованием. Осадок вторично растворяют в 10 мл дихлорметана и экстрагируют 10. мл воды, содержащей . иодистый барий (80 мг) и карбонат бария (70 мг). Фазы разделяют, водную фазу фильтруют.и величину рН устанавливают на уровне 6,5. Раствор подвергают сушке вымораживанием, получают порошок желтого цвета. Твердый продукт промывают ацетоном для растворения избытка иодистого бария, центрируют и выделяют светло-желтый продукт, который сушат в вакууме. Выход

13 мг (Л, 0,0004 мкг/мл).

Пример 2. Фильтрат культуры (см. пример 1) дает зону диаметром 17 мм при определении бактерицидной активности при пробе на КЯеЬб4еОРа аа оЯеиед, зону диаметром 38 мм при пробе КА Д и величину 3, при разбавлении 1:1 00000.

Осветленный фильтрат культуры (170 л) емпературой 5 С нереколируютв восходяо

528038

О щем потоке через колонку диаметром 22,86 см, заполненную до высоты 40,64 см активированным древесным углем "Фарнелл BO" с частицами размером 60-80 меш, предварительно промытого 1 н, соляной кислотой и 5 забуференного до рН 6 фосфатным буфером (скорость 800-1000 мл/мин). раствор промывают на у ле деионизиро» . ванной водой (10 л) и элюируют 20%-ным о ацетоном IlpH температуре 20 С. Активные 1О фракции (10 л) концентрируют выпариванием в вакууме при температуре ниже 30 С до о обьема 6 л и высушивают вымораживанием.

Получают 282 г сырого ММ 4550 (комплекс), Д 0,05 мкг/мл.

Пример 3. Колонку диаметром l см заполняют до высоты 6 см ионообменной смолой "Йауэкс 21К (20-50 мин по стандарту США, хлоридная форма). Слой смолы промывают четырьмя порциями по 4,7 мл

5%-ного водного метанола, после чего промывают 4,7 мл воды (одной порцией).

2 л фильтрата культуры получают как в примере 1 и переносят в колонку. Затем смолу промывают 504-ным водным метанолом о

25 для удаления загрязнений.

ММ 4550 (комплекс) элюируют со смолы 5%-ным раствором хлористого натрия в 50 /ном водном метаноле.

Фракции % 2-5 содержат 60% активноно вещества. Общий сухой вес этих фракций 210 мг.

Пример 4. К 10 л осветленного фильтрата культуры (см. пример 1) прибавляют 248 г сульфата натрия. Полученный раствор экстрагируют 2%-ным раствором кислого сульфата тетра-н-бутиламмония в дихлорметане (10 л) путем перемешивания в течение 30 мин. Фазы разделяют,и дихлорметановую фазу охлаждают до температуры 2ОС. Небольшое количество суспендированной воды удаляют путем фильтрова- ния через бумагу Батман N,)Р5 Ди«

; хлорметановый раствор концентрируют до

Объема 20 мл выпариванием в вакууме при о температуре ниже 30 С. Смолу, содержащую комплекс, осаждают 400 мл петролейного эфира при температуре 40-60ОС, Смолу собирают фильтрованием, повторно растворяют в 50 мл дихлорметана и экстрагируют 50 мл воды, содержащей

1 г иодистого бария и 1 r карбоната бария, встряхивая в течение 2 мин. Водную фазу, содержащую комплекс MM 4550 в форме бариевой соли, доводят до рН 6,5 и высушивают вымораживанием, Получают 317 мг сырого препарата

ММ 4 >50 (комплекс) с показателем

Э,0,001 мкг/мл. 60

Пример 5. Сырой препарат

ММ 4550 (комплекс), полученный по примеру 2, повторно растворяют в воде (12,5 г в 125 мл) и экстрагируют 125 мл

10%-ного раствора кислого суль ата тетра-н-бутиламмония в дихлорметане. Фазы разделяют, и дихлорметановую фазу подвергают обратной экстракции при помощи

100 мл воды, содержащей 190 г иодистоо го натрия, при температуре 2 С путем медленного перемешивания и установления величины рН водной фазы 6,4 2%-ным раствоОом бикарбоната натрия. Раствор высушивают вымораживанием, и твердое вещество промывают ацетоном.

Получают 88 м (70%) препарата смешанных солей ММ 4550 и ММ 13902 с величиной 0,002 мкг/мл против Р-лактамазы Esch. СО Г .

Пример 6. 1 г сырого ММ 4550 (комплекс), полученного по примеру 4, хроматсграфируют на сефадексе Р я5, исполь,зуя в качестве элюента смесь ацетон: во,да (4:6). Элюированне проводят со скоро1 стью 1,5 мл/мин, активные фракции обьединяют, концентоируют в вакууме при темпера1

1туре ниже 30 С и подвергают сушке вымо раживанием.

Получают 22 мг (88%) аморфного твердого вещества каштанового цвета и величи ной Д 0,005 мкг/мл, очистка 405о кратная.

Пример 7. ММ 4550 (комплекс) ° полученный по примеру 5, хроматографируют на колонке с целлюлозой (2,5 см х 32 см, Ватман СС 31) и элюируют смесью изопропанола с водой (7:3 об/об) со скоростью ,1,5 мл/мин. Бактерицидно-активные фракции обьединяют, концентрируют в вакууме при температуре ниже 30 С и сушат вымораживанием, Получают 40 мг коричневого аморфного препарата комплекса антибиоти ка с величиной Д 0,00007 мкг/мл. Очень низкая величййа,! о показывает, что активный материал Обладет повышен ойй степенью чистоты.

Пример 8. Фильтрат культуры (340 л), полученный по примеру 1, перколируют в восходящем потоке со скоростью

800-1 200 мл/мин через колонку

; (d = 22 86 см, 4 =- 27 94 см), запол, ненную углем "Фарнелл ВО . Колонку про мывают 20 л воды и элюируют в нисxorI«щем потоке смесью ацетона с водой (2:3 об/об) со скоростью 200-250 млlмин.

Собирают фракции обьемом 1 л. Фракции, .содержащие MN 4550 (комплекс), Определяют постановкой пробы K pg, Обьединяют (ll л) и концентрируют в вакууме при тем52803Р

7 пературе киже 30"С до обьема 5,5 л. Концентрат охлаждают до температуры 2 С, о прибавляют 5,5 л 2%-ного (вес/обьем) кислого сульфата тетра-н-бутиламмония в о дихлорметане с температурой - 5 С, и обе фазы перемешивают 2 мин.

Дихлорметановую фазу отделяют и прибавляют к 1 л 0,6%-ного раствора иодида о натрия при температуре 0 С. Обе фазы ос1О торожно перемешивают, и величину оН фазы о

Д постепенно доводят до 6,5-7,0 2Ь -ным вод ным раствором бикарбоната натрия, Водную фазу отделяют и высушивают выморажива нием. Высушенный твердый продукт экстра, гируют безводным ацетоном для растворения избытка иодида натрия, а ацетон удаляют из нерастворимого остатка в вакууме.

Получают 1,1 г порошка каштанового цвета. Степень очистки 125=-кратная.

Колонку диаметоом 2 5 см заполняют 1 порошко образной целлюлозой (Ватман СС 3 1, в смеси изопропанола с водой (7:3) до высоты слоя 32 см, 500 мг порошка каштанового цвета растворяют в 2 мл смеси

Я изопропанола с водой (7:3) и хроматографируют с применением того же растворителя при скорости элюировття. 1,5 мл/мин.

Из колонки собирают фракции обьемом по

3 мл, и те фракции, которые показывают характерные максимумы поглошепия при длине волны 285 нм, обьединяют, концентрируют и сушат вымораживанием для получения ММ 4550 (комплекс).

Получают 35 мг коричневого амора ного вещества, величина 3 „которого

О, 0001 мкг/мл, степень а >истки 600-кратная.

Пример 9, Фильтрат культуры (1100 л) после ферментапии g t . Q/in c(?09,О

АТСС 31 126 с величиной рН 6„5 и температурой 5оС перколируют со скоростью 3,3 л/мин через колонку (10,3 м х 1 м) пз гранулированного угля, Колонку промывают водой (60 л) и э:поируют смесью ацетон с водой (2:8 nG/oá) при температуре 80 С со скоростью

1,1 л/мин. Собирают 60 л, а последние 5 фракций — по 10 л. Фракции (40л), содержащие ММ 4550 (комплекс), обьедипяют 50 и концентрируют в вакууме при температуре ниже 30 С до обьема 32 л. Конценто о рат охлаждают до температуры 5 С, прибавляют 16 л 0,2%-ного раствора хлорида цетилдиметилбензиламмония в дихлор- M .U метане температурой 5 С и обе фазы перемешивают 5 мин .

Дихлорметановую фазу отделяют и внОсят в 3,75 л раствора иодистого натрия (0,4 о-ного) при температуре 5 C. Обе 60 фазы перемешивают 5 мин, водную фазу отделяют, сушат вымораживанием. Высушенный твердый продукт экстрагируют безводным ацетоном для растворения избытка иодистого натрия, и остаточное твердое вешество сушат в вакууме.

Получают 2,87 г порошка рыжеватокоричневого цвета. Степень выделения комп« лекса на этой стадии 6%, степень очистки, 160-кратная..

Колонку диаметром 63 мм заполняют порошкообразной целлюлозой (Ватман СС3.1 1 в смеси изопропанола с .водой (7:3) до высоты слоя 300 мм. 2,0 г порошка рыжевато-коричневого цвета растворяют в 5 мл смеси изопропанола с водой (7:3) и хроматогрфируют с той же системой растворителей со -скоростью 3 мл/мин. Фракции, содержашие ММ 4.550 (комплекс), обьединя;от, концентрируют выпариванием в вакууме при температуре ниже 30оС и подвергают сушке вымораживанием..

Получакгг 207 мг гвердого вешества коричневого цвета, Степень выделения на этой стадии 51%, степень очистки 5-кратная, Колонку диаметром 16 мм заполняют порошкообразнсй целлюлозой (ВатманСС 31) в смеси н-пропанола с водой (4:1) до высоты слоя 300 мм. 198 мг коричневого твердого вешсства растворяют в смесл воды с н-пропанолом (1:1) и хроматографир "oT с системой растворителей н-пропанол,вода (4:1) со скоростью течения 0,5 мл/мин.

Собирают фракции по 6 мл, проводят биоанализ против Кfеbgj8/LQ 08iояепг9 и снимают счектр поглощения каждой фракции в

УФ-области, Фракции № 23-28 содержат двунатриевую соль антлбиотика ММ 13902.

Эти фракции обьединяют, концентрируют в вакууме и подвергают сушке вымораживанием.

Получают 30 мг твердого продукта.

Фракции № 29 40 содержат антибиотик

ММ. 4550. Эти фракции обьединяют, концентрируют в вакууме и сушат вымораживанием. Получают 53 мг твердого продукта, который содержит соль антибиотика

ММ 4450, загрязненную небольшим коли.е твом соли антибиотика ММ 13902, ll р и м е р 10. Получение антибиоти ка ММ 13902. Пробу спор 5tt .01<чосеиЯ

АТСС 3 1 1 26 вы держивают в пробирках с сухой почвой в закрытом контейнере с агентом осушения при температуре 20 С. Нео большое количество пробы почвы (20 мг) переносят в колбу Эрленмейера обьемом

500 мл, содержашую среду следуюшего состава (в г/л):

528038

20,0

10,0

Qo 1 рН устапав5

Моногидр&т глюкозы

Мука из соевых бобов

Деионизированная вода, л.

Перед стерилизацией валичину ливают 6,5.

До 1

Ферментационную среду перемешивают со скоростью 106 об/мии, температура фермено тации 30 С,. скорость аэрации 3 200 л/мин.60

Колбу с содержимым подверга1от инкубации в течение 30 час при температуре

28 С. 2 мл инокулята высевают на твердый агар-агар в колбе Ру, 10

Состав агар-агаровой среды:

Овощной сок У-8, мл

Агар-агар, r

Деионизированная вода, л рН среды до стерилизации 6,0.

Колбу с содержимым инкубируют при температуре 30 С в течение 2 дней. Затем избыточную жидкость удаляют из колбы и инкубируют еше .4 суток.

50 мл деионизированной воды, содержащей 0,02% "Таина 80", вносят в культуру в колбе Ру, и споры суспендируют встряхиванием.

Суспензию спор вносят в 75 л среды в бродильном чане обьемом 100 л.

Состав среды (в г/л):

Мука из соевых бобов 10,0

Моногидрат глюкозы 20,0

Водопроводная вода, л Qo 1

Для регулирования пенообразования к ферментационной среде до стерилизации прибавляют 50 мл 10%-ного " 1луроника Lj8 1".

Среду стерилизуют водяным паром в бродильном чане в течение 20 мин при температуре о

120 С. Культуру перемешивают со скоростью 140 об/мин и аэрируют стерильным воздухом со скоростью 75 л/мин.

Температуру поддерживают на уровне

28 С, и после инкубации в течение 48 час о содержимое чана прибавляют1 к 1500 л сте- 4о рильной ферментационной среды в бродильном чане емкостью. 2000 л.

Состав ферментационной среды (в г/л):

Соевая мука. 10,0

Моногидрат глюкозы 20,0 45

Мел 0,2

Хлористый кобальт 0,001

Сул фат натрия 1,0

Водопроводная вода, л l1o 1500 рН среды до стерилизации 6,0.

Для предотвращения пенообразования в среду до стерилизации прибавляют 3 л

10%-ного "Плуроника Ь 81 в масле из соевых бобов. рН среды после стерилизации 7,0. (устанавливают стерильным раство55 ром гидрата окиси натрия), Продукт ферментации собирают через

60 час и осветляют центрифугированием.

Активность 340 ед/мл.

Фильт)зат культуры (1050 л) темпера» турой 10 С a pH 8 экстрагируют дихлорметаном (810 л). Экстрагент содержит

1200 г хлорида цетилдиметилбензиламмония.

Фазы разделяют в центрифуге Шарплеса.

Дихлорметановую фазу (1 300 л) подвергают обратной экстракции водным раствором иодистого натрия (7 л воды и 210 г иодистого натрия), Фазы разделяют по весу. Величину рН устанавливают 7,0-7,7 соляной кислотой и фильтруют.

7 л экстракта, содержащего иодистый натрий, с активностью 21900 ед/мл про» пускают через колонку, заполненную смолой сефадекс Q AE" в фосфатном буфере (0,5 М}, содержащем хлористый натрий (0,3 М), со скоростью 50 мл/мин при температуре 5 C. Колонку элюируют 0,7 М раствором хлористого натрия в 0,05М фосфатном буфере с рН и при температуре

5 С со скоростью элюирования 25 мл/мин.

2 л элюата отбрасывают и собирают 90 фракций.

Фракции ¹ 50-6 2 объединяют, устанавливают рН 7, получают 1440 мл антибиотика ММ 13902 с активностью 71000ед/мл.

К объединенным фракциям прибавляют хло рпстый натрий (5 r/100 мл), и эту жидо кость перколируют при температуре 5 С через колонку, заполненную смолой Амберлит Х )й-4", со скоростью 20 мл/мин.

Антибиотик ММ 13902 элюируют при комнатной температуре дистйллированной водой (200 мл), после чего элюируют водным

50% ным метанолом, 1 л элюата выпаривают при температуре о ниже 30 С при пониженном давлении до обьема 70 мл, устанавливают рН 7 и сушат вымораживанием. Получают 1,62 г корич невого твердого продукта, представляющего собой частично очишенную соль ММ 13902 с активностью 3700 ед/мл.

1 r полученного продукта хроматогрфируют на колонке целлюлозы и элюируют смесью н-иропанола и воды (4:1) при скорости потока 2,5 мл/мин. 170 мл элюата отбрасывают и собирают 100 фракций по

15 мл. фракции ¹ 37 3 (89 мл) содержашие двуиатриевую соль ММ 13902, выпаривак т опри температуре ниже 30 <. при пониженном давлении для удаления н -пропанола и сушат вымораживаии .м. Получают 21 9 мт желтоватого порошка с активностью

73000 е д/ л1л.

Антибиотик ММ N 3902 представляет, собой твердую карбоновую кислоту, находящуюся в форме натриевой сопи и имеющую следующие,"Ырактеристики:

1. Хорошо растворим в воде метанох?е и нерастворим в хлороформе, диэтиловом заире и углеводородах.

2, Максимум поглощения в ультрафиолетовой области при длине опны 308 пм при показателе екстинкции E, " 343. 1О

3. Максимумы поглощения в инфракрасной области при длине волны 3450, 2950, 1750, 1620, 1510„1400 и 1260 см

4, Обладает бактерицидной активностью вотношении Sto.phy0ococcug vuieuS,Иос 0- 16 ,008 8056(048g Е8С ВР4СЬ4О СОИМ КВЬ8!ВОРС!

oe.-ojeries,-Pvokeug wivobi ki8,9@3 wgneP д & ур, Р8е иаощапд 8 0 В и ф и а8а.

5. Оказывает инергетическое воэдейс..:вие в сочетании с пенипил п ном и цефалоспоринами.

Формула изобретения

Способ получения антибиотика или его солей, отличающийся тем, что культуру Югер(омусе8 а1 асеп8

АТСС 31126 выращивают в аеробных условиях на среде, содериащей источники углерода и азота, минеральные соли, с после=дующим выделением антибиотического комплекса и разделением его на компоненты известными приемами.

Составитель Г, Смирнова

Редактор Л. Ушакова Техред И. Асталош Корректор Н. Золотовская

Заказ 711/39 Тираж 575 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР

YIo делам изобретений H открытий

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., g. 4/5

Филиал ППП Патент", г. Ужгород, уп. Проектная, 4