Способ получения -глютаминовой кислоты и ее производных

Способ получения -глютаминовой кислоты и ее производных

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

а, „с, | 4,.0 528338

ОПИСАН И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (irrQ + (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 01.06.71 (21) 1680103/13 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

Опубликовано 15.09.76. Бюллетень № 34

Дата опубликования описания 14.10.76 (51) lt. Кл, - С 12В 13/06

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 547.466(088.8) (72) Авторы

Н. И. Жданова, P. М. Балицкая, Т. Б, Касаткина, H. Н. Кузнецова, Л. М. Евстюгов-Бабаев и А. Ф, Шолин пзоопетенпя

I (71) Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ГЛ1ОТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ

И EE ПРОИЗВОДНЫХ

Изобретение относится к микробиологическому синтезу, а именно, к способу получения

1-глютаминовой кислоты путем культивирования продуцирующих ее микроорганизмов.

Известен способ получения 1-глютаминовой кислоты, согласно которому выращивают продуцирующие ее микроорганизмы вида Micrococcus glutamicus в аэробных условиях на питательной среде, содержащей мелассу, мочевину, сернокислый магний, карбонат кальция, однозамещенный фосфат кальция, после чего биомассы отделяют от культуральной жидкости, фильтруют ее, а фильтрат осветляют, упаривают и выделяют кристаллы глютаминовой кислоты при добавлении соляной кислоты.

Высокое содержание биотина в мелассе препятствует синтезу глютаминовой кислоты.

Избыток биотина удаляют, например предварительной ооработкой мелассы активированным углем, смолами, введением биологически активных веществ или добавлением химических веществ, разрушающих биотин, или заменой части мелассы чистым сахаром.

Для увеличения выхода 1 -глютаминовой кислоты и упрощения процесса, по предлагаемому способу из вида М сгососсцз glutBmlcus используют штаммы «ВНИИгенетика 3144» и

«ВНИИгенетика 2943», одновременно вводят в культуральную жидкость для осаждения биомассы неорганические кислоты и окись кальция до рН 5. В качестве неорганических кислот используют 0,5 — 2% 73% -ной ортофосфорной кислоты и смесь 0,1 — 0,5 вес. % соля5 пой и 0,1 — 0,5 вес. % ортофосфорной кислот.

Используемые штаммы «ВНИИгенетика

3144» и «ВНИИгенетика 2943» получают многоэтапной селекцией с применением мутагенных факторов, например паров диэтил10 сульфата, ультрафиолетовых лучей, из исходного штамма «ВНИИгенетпка 490».

Применяемые штаммы имеют следующ .с характеристики.

Пример l. Односуточнуlo культуру MiсгоI5 сoccus glutamicus 3144, выращенную на кocÿках с агаром Хоттингера, пересевают в колбы

Эрленмейера емкостью 250 мл с посевной средой, содержащей, %: мелассы 8.. хl-l.:Cl 0 5, кукурузного экстракта 0,3, 1х.НРО4 0,05., 20 MgSO4. 7Н.О 0,03, Са СОз 1.0. Дооа влснисм

60%-ного раствора едкого патра устанавливают рН посевной среды до 7.2, Среду стернлизуют 30 мин при 0.8 атм. Объем питатечьной среды в каждой колбе 30 — 50 см . Выра25 щивание посевного материала в колбах производят в течение 24 ч на качалке 200-220 об/мин, В посевном материале титр клток на 1 мл составляет 2 — -2,5 10 -.

Из каждой колбы перенося" по 2"„ поссч30 ного материала в 20-литровые фермеягеры, с

528338

ВНИИгенетика 3144

Агаризованная среда

Хоттингера: рост 1 сут— клетки удлиненные, размером 2,2 мкм

Агаризованная среда

Хоттингера: рост 1 сут— клетки удлиненные, размером 1,5 мкм

Морфология

17,5

Рост 42 — 48 ч

3,4 . 10д

Рост 42 — 48 ч

3,1 10

8,1 . 10 — 9

12,6 . 10

18,7 24,8

18,7

41 — 48 ч

41 — 48 ч

Меласса 20

КНдРОд 0,5

MgSO4 . 7НдО 0,3

Мел 1

Мочевина 1,2

РН среды 7,0 — 7,2

27,3 г/л глютаминовой кислоты

38,2 г/л глютаминовой кислоты

Отношение к концентрации биотина в минеральной среде:

Концентрация биотина в минеральной среде, обеспечивающая максимальный выход глютаминовой кислоты, мкг/л

Максимальная концентрация клеток в среде (42 — 48 ч ферментации):

Количество клеток в 1 мл

Продукти вност ь шт аммов

Выход глютаминовой кислоты на 1 клетку, мг

Отношение к условиям аэрации

Количество растворенного кислорода, обеспечивающее максимальный выход глютаминовой кислоты в среде с мелассой, мг/л мин

Накопление глютаминовой кислоты (20 л ферментера)

Среда, э питательной средой, имеющей рН 6,8 — 7, следующего состава, :

Мела сса 20

Мочевина 1,2

КН Р04 0,5

CaCOç 1,0

MgSO4 7НдО 0,3

Питательную среду без мочевины стерилизуют в ферментерах при 124 — 126 С в течение

1 ч, а затем охлаждают до 30 С. 40%-ный раствор мочевины стерилизуют в автоклаве отдельно при 0,5 атм в течение 30 мин и добавляют в основную питательную среду сразу перед посевом.

Процесс фер ментации проводят при 28—

30 С в условиях аэрации, при объемном соотношении подаваемого в 1 мин воздуха воздух: среда=1: l, при непрерывном перемешивании среды. После 41 — 48 ч ферментации в культуральной среде накапливается 32,2 г/л глютаминовой кислоты; темно-коричневая культуральная среда имеет уд., вес 1,05 г/см, р 1,6 с. í. п 0,3600, рН 6,8.

В полученную культуральную среду, нагретую до 50 С, для осаждения биомассы добавляют 0,5 /е негашеной извести и перемешивают 10 мин, после чего при перемешивании вводят 1% от веса среды 73 /о-ной ортофосфорной кислоты и полученный раствор доводят до кипения. Затем охлаждают до 70 С и филыру|от под давлением через бельтинг.

Фильтрат имеет рН 5. Осадок на фильтре промывают водой (10% от объема фильтрата), промывную воду присоединяют к фильт15 рату. Влажный осадок содержащий до 50% воды, количество которого составляет 5 вес. % от веса культуральной среды, после высушивания в токе нагретого воздуха до 80 — 100 С представляет собой легкие серого цвета ко20 мочки, которые легко крошатся и истираются в порошок, а при поджигании тлеют подобно

528338

60

5 древесному углю. Высушенный осадок содержит около 45% органических веществ (биомасса микроорганизмов) и около 55 /О неорганических солей (трикальций фосфат) .

Фильтрат культуральной среды (оптическая плотность D-2; l — 10 мм; Х вЂ” 535 ммк) пропускают через колонку, заполненную ионосорбентом ИА-1Ф, в количестве 5 объемов на 1 объем смолы. Остаток жидкости из колонки вытесняется подкисленной до рН 5 водой и его соединяют с осветленным раствором.

Перед проведением следующего цикла смолу регенерируют раствором, содержащим

2 вес. % NBOH и 2 вес. % NHg. Смолу отмывают от щелочи до рН 11, затем пропускают через колонку 1 объем 1 /О-ной соляной кислоты, 2 объема воды, чтобы величина рН раствора на выходе колонки составляла 2,5.

Раствор после осветления упаривают под вакуумом при 55 С до содержания сухих веществ 47%, подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 3,2, затем охлаждают до 10 С и выдерживают 20 ч.

До подкисления в раствор добавляют кристаллы глютаминовой кислоты в качестве затравки для кристаллизации глютаминовой кислоты. Выпавшие кристаллы глютаминовой кислоты отделяют на фильтрующей центрифуге (1 000 g, 30 мин) до толщины слоя кристаллов 5 см. Кристаллы промывают 5% от веса упаренного раствора холодной воды, подкисленной до рН 3,2. Промывание воды соединяют с маточным раствором.

Кристаллы глютаминовой кислоты выгружают из центрифуги.

В случае получения глютамата натрия к сырым кристаллам глютаминовой кислоты добавляют воду, чтобы отношение веса воды к сухой глютаминовой кислоте было равно

2: 1, и к полученной таким образом суспензии при перемешивании постепенно добавляют

50%-ный раствор едкого натра до рН 7,0. Расход щелочи составляет 0,18 — 0,20% от веса суспензии.

Раствор нагревают до 80 С и упаривают под вакуумом до содержания сухих веществ

55% (в пересчете на моногидрат глютамата натрия) .

B упаренный раствор вносят затравку кристаллов глютамата натрия, затем охлаждают в течение 6 ч до 10 С и оставляют при этой температуре на 18 ч для кристаллизации глютамата натрия.

Выпавшие кристаллы глютамата натрия отделяют на центрифуге и высушивают при

50 С.

Полученный продукт 1 - моноглютамат натрия, моногидрат — бесцветный мелкокристаллический порошок.

Пример 2. Используют штамм Micrococcus glutamicus ВНИИгенетика 2943.

Выращивание посевного материала и условия ферментации те же, что и в примере 1.

Через 48 ч культуральная среда содержит

27,3 г/л глютаминовой кислоты и 22 г/л остаточных сахаров. Выделение глютамнновой кис;IoTbI и получение глютамата натрия осуществляют так же, как описано в примере 1. .Пример 3, Штамм-продуцент и условия опыта такие же, как в примере 1. Отличие заключается в том, что для осаждения биомассы к культуральной среде добавляют 1,5% ортофосфорной кислоты, культуральную среду нагревают до 100 С и поддерживают слабое кипение в течение 20 мин, затем охлаждают до 70 С и фильтруют для отделения биомассы и других взвесей.

П р и м ер 4. Штамм-продуцент и условия проведения опыта такие, как описано в примере 2. Отличие состоит в том, что для осаждения биомассы в культуральную среду, нагретую до 50 С, добавляют при перемешивании 5% окиси кальция, а затем через 10 мин

0,5% концентрированной соляной кислоты и

0,5% ортофосфорной кислоты от веса культуральной жидкости. жидкость нагревают до

100 С и после охлаждения фильтруют через бельтинг-ткань.

Последующие операции выделения глютамнновой кислоты и получения глютамата натрия такие же, как в примере 1.

Формула изобретения

1. Способ получения 1 -глютаминовой кислоты и ее производных путем глубинного выращивания продуцирующих ее микроорганизмов вида Micrococcus glutamicus в аэробных условиях на питательной среде, содержащей мелассу, мочевину, сернокислый магний, карбонат кальция, однозамещенный фосфат кальция, с последующим отделением биомассы от культуральной жидкости путем введения в нее окиси кальция и неорганических кислот для осаждения биомассы, фильтрации культуральной жидкости, осветленпя ее на ионообменных смолах, упариванпя раствора, добавления соляной кислоты для осаждения кристаллов 1 -глютаминовой кислоты с последующпм получением ее производных, например 1 -глютамата натрия, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода 1-глютаминовой кислоты и упрощения процесса, из вида Micrococcus glutamicus используют штаммы «ВНИИгенетика 3144» и (ВНИИгенетика 2943», а введение в культуральную жидкость неорганических кислот и окиси кальция для осаждения биомассы производят одновременно до рН, преимущественно равного 5.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве неорганической кислоты используют 0,5 — 2% 73% -ной ортофосфорной кислоты.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве неорганических кислот используют смесь 0,1 — 0,5 вес. % соляной и

0,1 — 0,5 вес. %ортофосфорной кислот.