Способ получения водонерастворимых ферментов

Способ получения водонерастворимых ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И (-:-А "" Н ЧЙ"й

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик (»)530885

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— и (22) Заявлено 08.02.74(21) 1989900/13 (51) М. Кл.

С 07 & 7/00//

//С 1" 2 13/10 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 05.10.76. Бюллетень № 37 (45) Дата опубликования описания 16.02.77

Государственный комитет

Совета Министров СССР ао делам изаоретений и открытий (53) УДК 577.15. .07 (088.8) А. И. Кестнер, М. О. Мандель, В. Н. Федосеев и Э. Х. Сиймер (72) Авторы изобретения

Таллинский политехнический институт (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОНЕРАСТВОРИМЫХ ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения водонерастворимых ферментов, который может найти применение для получения связанных в гель ферментов, в частности для иммобилизации низкомолекулярных ферментов.

Известны способы получения водонерастворимых ферментов на разных органических носителях, в частности на поперечнс .сшитом полиакриламиде, который обладает химической стойкостью и отличается несложной и дешевой технологией его приготовления.

Для иммобилизации ферментов на полиакриламидном геле применяют сорбцию, связывание ферментов глутаровым альдегидом и другие способы.

По сравнению с иммобилизацией ферменгов на готовых зернах полиакриламида способ включения ферментов в полиакриламидный гель во время образования последнего тутем введения их в раствор мономеров и тнициаторов и проведения полимеризации в присутствии ферментов, обладает рядом преимуществ.

Согласно одному из известпых споссбов (см. патент Японии ¹ 70-15787) для улучшения связывания фермента в полимеризационную смесь вводят модификаторы.

Однако получаемые таким образом гели обладают недостаточной механической прочностью, легко сжимаются в установках и три использовании их не выявляют в полной мере своей активности.

Целью изобретения является повышение механической и энзиматической стабильности и уменьшение гидродинамическогс сопротивления получаемых катализаторов.

Поставленная цель достигается тем, что полимеризуемую смесь вместе с ферментом впитывают в пористый неорганический носитель и полимеризацию проводят в порах последнего.

Пористый неорганический носитель мо>кет представлять собой кремнезернистый или металлический материал с диаметром пор свыше 70 нм, 53

Полимеризационная смесь предпочтительно состоит из 7-12% акриламида, 0,7-1,2% N, М -метиленбисакриламида и полимеризацию проводят под действием

Я Я (-тетраметилэтилендиамина. В качестве .лодификатора целесообразно использовать глутаровый альдегид, который вводят в полимеризационную смесь в концентрации 0,5-2,0%.

Полученные по предлагаемому способу препараты представляют собой упроченный неорганическим скелетом полиакриламидный гель, в структуру которого включен фермент. Энзиматические свойства препаратов в основном зависят от состава полимаризационной смеси. Наряду с немодифициро ванным гелем этим способом целесообразно полимеризовать смесь, содержащую в качестве модифицирующего сшивающего агента глутаровый альдегид.

Полученные ферменты характеризуются повышенной механической прочностью по сравнению с известными препаратами того же состава, но не содержаши;ли неорганический скелет. Применение этих препаратов позволяет улучшить контакт катализатора с субстратом в колонках, реакторах перемешивания и других установках.

Пример 1. Приготовляют 500:лл смеси бензилпенициллинацилазы активностью

lOOOO ф.е. /мл (за единицу действия бензилпенициллинацилазы принимают такое ее количество, которое гидролизует калиевую соль бензилпенициллина в 0,63%-ном расто воре при 40 + 1 С и рН 7,5 с образованием 1 моЛ 6- аминопенициллановой кислоты в 1 час), содержащей (в %): акри( ламид 9> N,N --метиленбисакриламид 1; глутаровый альдегид 2,0; N,N,N,N — тетраметилэтилендиамин 1. Полученную о смесь охлаждают до 5 С и пропитывают ею 250 г зерен сухого сорбента "Сферохром-2" (Горьковская опытная база

ВНИИНП, фракция 0,1-03 мм) в течение нескольких минут. Затем при температуо ре, не превышающей 5 С, в перемешиваемые зерна сорбента добавляют по каплям

10 мл 50%-ного водного раствора персульфата аммония, После образования геля в порах сорбента материал многократно промывают. Получают 730 г препарата активностью 2740 ф.е./г влажного материала. Выявляемая активность по сравнению с теоретически ожидаемой

66.6%.

200 г влажного иммобилизованного фермента бензилпенициллинацилазы с активностью 2740ф.е./r инкубируют в течение

llO мин в 350 г (0,97 моль) калиевой соли бензилпенициллина 7000 мл дистило лированной воды при 40+1 С и автомати0885 б

lO

l5

29

39 ческом поддерживании рН 7,5 25%-ным аммиаком в реакторе периодического действия с пере мешив ание м. П олу чают раствор с содержанием 6-аминопенициллановой кислоты 0,89 моль (91,9% от теории).

Пример 2. Водонерастворимый фермент трипсин (фирмы "Спофа", ЧССР) получают по примеру 1, но при этом используют 1 мл фермента с эстеразной активностью 100 Е/мл. 3а единицу активности "E" трипсина принимают такое количество фермента, которое гидролизует

1 мкмоль (0,02 М раствор) специфического субстрата — с — Й -бензоил- L -аргинин метилового эфира. Раствором фермента пропитывают 0,35 г сорбента "StevchamoV (фирмы "Schuchat hhu chem "). Получают 1,65 г влажного и:лмобилизованного препарата трипсина активностью 4,25 Е/г.

Выявляемая активность по сравнению с теоретически ожидае;лой 7,0%.

19,7 г влажного сорбента помещают в колонку сечением 4,16 см (4,65 г/см ) и пропускают через нее воду с максимальной скоростью 33,3 мл/мин. Полиакриламидный гель с размером частиц до 0,5 мм в тех же условиях позволяет повысить скорость протекания до 5 мг/мин.

Пример 3. Водонерастворимый фермент трипсин получают по примеру 2, но в полимеризационную смесь добавляют

0,1 :мл 5%-ного глутарового альдегида.

Получают 1,7 г влажного иммобиллзованного препарата трипсина в носителе

"Herchomol" активностью 20,6 E/ã. Выявляемая активность по сравнению по сравнению с теоретически ожидаемой 35%.

Формула изобретения

1. Способ получения водонерастворимых ферментов путем заключения фермента в полиакриламидный гель полимеризацией смеси акрильных мономеров и модификаторов в растворе фермента, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения механической и энзиматической стабильности и уменьшения гидродинамического сопротивления получаемых ферментов, полимеризуемую смесь вместе с ферментом впитывают в пористый неорганический носитель и полимеризацию проводят в порах последнего.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю— шийся тем, что пористый неорганический носитель представляет собой крем незернистый или металлический материал с диаметром пор свыше 70 нм.

3. Способ по и. 1, о т л и ч а ю— шийся тем, что полимеризационная смесь включает 7-12% акриламида, 530885

Составитель М. Андреева

Редактор 3. Бородкина Техред H. Андрейчук Корректор В. Куприянов

Заказ 5402!125 Тираж 575 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4.

0,7-1,2% N,N -метиленбисакриламида и полимеризацию проводят под действием N,N, тетраметилэтилендиамина.

4. Способ по пп. 1 и 3, о т л и ч аю ш и и с я тем, что в качестве модификатора используют глутаровый альдегид, который вводят в полимеризационную смесь в концентрации 0,5-2,0%.