Способ получения иммобилизованных вполиакриламидном геле ферментов

Способ получения иммобилизованных вполиакриламидном геле ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОЛ ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕ Н ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (»)530886

/

1 ..ЪЪ. (51) М. Ел.

С 076 7/02 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 04.06.75 (21) 2139891/04 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 05.10.76.Бюллетень № 37 (45) Дата опубликования описания 15.02.77

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изооретений н открытий (53) УДК 577. 15.07 (088.8) М. О. Мандель, B. A. Кросинг, Э. Х. Сиймер и А. И. Кестнер (72) Авторы изобретения

Таллинский политехнический институт (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В

ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к технологии получения иммобилизованных ферментов, в частности иммобилизованных гидролаз, для применения их в пищевой промышленности.

Среди методов иммобилизации ферментов широкое применение находит включение их в полиакриламидный гель путем механического захвата или с дополнительным воздействием бифункциональных сшивающих реагентов. Иммобилизованные в полиакриламидном геле ферменты обладают хорошей химической стойкостью, приготовление их просто и дешево. Особенно целесообразно получать и применять иммобилизован- 15 ные ферменты в форме сферических микрогранул. Для получения сферических микр<>гранул иммобилизованных в полиакриламидном геле ферментов рекомендован метод полимеризации диспергированной в органическом растворителе полимеризационной смеси.

Полимеризацию осуществляют химическим методом в присутствии окислительновосстановительных инициаторов длитель2 ным перемешиванием. Полученные гранули отличаются большой дисперсностью (13.

Известен также способ получения связанных в полиакриламидном геле ферментов в форме сферических микрогранул требуемого размера, по которому водных растворов исходных веществ полимера и ферментов растворы диспергируют в специальной колонке (21. По такому способу полимеризационную смесь диспергируют в вазелиновое масло при помощи вибрирующего капилляра и полимеризация происходит под действием освещения.

Вышеописанный способ применим для иммобилизации ряда ферментов. Однако для некоторых ферментов полимеризация путем окислительно- восстановительного инициирования является более эффективной, чем фотохимическая полимеризация под действием освещения, которое может вызвать инактивирование ферментов. В качестве одного инициатора фотополимеризации применяют дорогостоящий катализатор-рибофлавин (витамин В), 530886

Осуществление экисилитсльно-восстановительного иниц..ирэвания при получении в полиакриламидном геле иммобилизованны: - фруктэфуранозидазы (инвертазы), бензилпенициллинамидогидролазы (пенициллинамидазы) и других ферментов в присут ствиии модификаторов приводит к значительному росту активности иммобилизованного фермента.

Для получения иммэбилизованных ферментов окислительно-восстановительным инициированием аналэгичнэ приведеннэму прототипу, где полимеризация происходит под действием освещения, необходимо проводить смешивание одного из инициаторов (предпочтительно персульфата аммония) с остальными компонентами непосредственно перед поступлением смеси в колонку.

Предварительный контакт инициаторов полимеризации с другими компонентами может вызвать преждевременную полимеризацию или инактивацию фермента.

0елью изобретения является повышение активности иммобилизэвапных ферментов.

Поставленная цель достигается проведением процесса пэлимеризации пэд действием окислительно-восстановительных инициаторов, приче: инициатор (предпочтительно персульфат аммония) досавляют к реакционной смеси в количестве 0,5 — 1,0 % и лучше не раньш, чем за 0,5 — 1,0 сек перед диспергирэванием ее в масло, например вазелинэвое, Необходимая бь строга смешивания при диспергирэвании достигается том, что реакционная среда BBogHTcsl в масло через вибрирующий капилляр, При зтэм раствор окислителя (персульфат аммония) направляют в колонку ерез внешнюю трубку, а остальные компоненты с.. еси (монэмеры, фермент и N g I N, тетраметилэтилен1 диамин) — через цецтральнуо.

Пример l. Приготовляют 145 мл раствора фермента в ацегатном буфере

,рН 4,5) с активностью 191 Е/мл, содержащего (в %); акриламида 12,6 N, N -метиленбисакриламид 1,4 N,N, М, N, -тетраметилэтчлсндиам".í 1,0, ангидрид итакэнэвой кислсгы 0,2.

Кроме того, готовят 145 мл 1,5 о -нэго раствора - ерсульфата аммония в ацетатном буфере (pH 4,5) .

Приготовленные растворы охлажда эт ,-О до +з С и вводят через вибрирующий (час-1 тога вибрации 960 мин ) капилляр со скоростью 20 мл/мин в колонку с вазелиновым маслом. Через 15 мин непрерывной работы отделяют готовую иммобилизованную инвертазу от масла центрифугированием на корзиночной центрифуге и промывают до исч . -+ новения следов масла. Получают 258,7 г геля с активностью в среднем 70,5 E/r влажного и с выходом 66% от исходной активности растворов.

2,5 r этого материала помещают в реактор объемом 50 мл с 40О/-ным раствором рафинаднэй мелассы (отходный продукт

Джамбульскэго сахарного комбината) . Гидрои лиз проводят при 50 С и рН 4 8 в течение 2 час степени превращения сахара до

И, 90%, Таким же способом проводят 50 пик лов гидролиза и собирают 2,5 л инвертного сиропа, который может быть использован в кондитерской промышленности в производстве помадных конфет.

Пример 2. Иммобилизованную в полиакриламидном геле инвертазу получают так же, как в примере 1, но раствор инициатора (персульфат аммония) приготовляют в растворе фермента с активностью

26

191 E/ìë. Получают 263 г влажного геля с активностью в среднем 102 Е/r и с выходом 48, 3% от исходной активности растворов .

Пример 3. Иммобилизованную

И в полиакриламидном геле инвертазу получают так же, как в примере 2, но применяют ферментный раствор с активностью

390 E/ã. Получают 247 г влажного геля с активностью в среднем 183 Е/г и с выходом 43,9% от исходной активности растЗО воров, Применение предлагаемого способа позволяет снизить себестоимость получаемых иммобилизованных ферментов.

Формула изобретения

1. Способ получения иммобилизованных в полиакриламидном геле ферментов в виде ф сферических микрогранул посредством диспергирования в масло- подвергающейся полимеризации смеси через вибрирующий капилляр, отличающийся тем,что, с целью повышения активности иммобилизованных фермЕнтов перед диспергированиек в масло к реакционной смеси добавляют окислительно-восстановительный инициатор полимеризации, например персульфат аммония,в количестве 0,5 - 1,0 %.

2. пособ по п. 1, о тли чаюшийся тем, что инициатор полимеризации добавляют K реакционной смеси не раньше, чем за 0,5 — 1,0 сек.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

f. н. и Ваап,k Mosbach and К.Mosbnck, Biockim.

Siophus . Acta., 2б6,253, 4 972; S. 6 ев1ге 3ius, В.MattiаЛЬО аПС(К.htOSgaCk, Eur- Ë.aiaehem., З6,69ЛВгЗ.

2. Авт. св. СССР ¹ 414301, кл. С 14

30. 09. 1 97 1 (прототип) .