Способ получения производных 7-амино-3-цефем-4-карбоновой кислоты

Способ получения производных 7-амино-3-цефем-4-карбоновой кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДИТВЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (и) 532619 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлеио20.03.75 (21) 2115045/04 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано25.10.76.Бюллетень №39 (45) Дата опубликования описания 24-.02.77 (51) М. Кл.о

С 12 Э 9/00

Гооударственный комитет

Совета Министров СССР по делам изооретеннй и открытий (5З) УДК 547.869.07 (088.8) E. М. Савицкая, П. С. Ныс, Н. Н Шелленберг, Е. Я. Зинченко, Н. М. Рябова, N. М. Левитов, Э. В. Кольцова, И. B. Березин и В.-Ю. К. Шведас (72) Авторы изобретения

Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ 7 АМИНО 3 ЦЕФЕМ

-4-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения производных

7-аминс-3-цефем-5-карбоновой кислоты, которые находят применение в синтезе антибиотиков. 5

Известны способь. получения производных 7-амино-З-цефем-4-.=карбоновой кислоты. Известны химические способы расщепления цефалоспорина С, например, хлорированием последнего с последующим превраще-10 нием полученного при этом имидохлорида в иминоэфир путем обработки спиртом, который затем гидропизуют(1). Известен, в частности, способ получения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-AllUK) l5 путем восстановительного расщепления цейалоспорина С в присутствии катализатора(2).

Известны также ферментативиые способы получения 7-AQUK, основанные на расщеп- 20 пении 7-бензил (феноксиметил)-ацетамидодезацетоксицефалоспорановой кислоты в присутствии деацилирующего фермента из микроорганизма Вас,iaaf us 61тлрЯек

 — 400 (3) и микроорганизмов

2

Аг Ъ оbacter S ml 8e А, СС <5t99 КЕичуега c 4 ay5i Еа ДТСС 24z85,Proteus г e get 1 АТСС 9250 и М1с ococcus вр.ll3RZ

3-2 75 3 Е 43.

Сущность способа заключается в ток, что гидролиэ годных растворов 7-бензипацетамидодезапетоксицефалоспорановойкислоты (7-БАДЦК ) или 7-феноксиметипацетамидодезацетоксицефапоспорановой кислоты (7-ФАДЦК), взятых в концентрации 1-10 мгlмл проводят обычно при рН 7-8, температуре

20-45оС в течение 3-80 час в присутствии деацилирующего фермента в виде культуральной жидкости, микробной биомассы, очищенного фермента или нерастворимого фермента, полученного адсорбцией на целите. По окончании гидропиза к раствору добавляют равный объем ацетона, устанавливаю рН 4,0, выдерживают смесь в течение ночи и отделяют осадок -AllUK.

Выделение 7-AllUK описано для гидропт « за с деацилирующим ферментом иэ микроорганизма prg4eus еИрег1 АТСС 9250. В этом слу.ае получа.от 7-АДЦК низкого каэ32619

ОН В

6ОО чества — 93%-ной чистоты, При использовании других микроорганизмов 7 АДЦК не выделяют кз реакционной смеси, так как глубина гидролиза составляет только 4060% Ь

Такой способ характеризуется низкой гидролитической активностью кспош»зуемых ферментных препаратов, вследствие чего длительность гидролиза даже для малых концентраций субстрата очень велика (80 час) 1О

Применение для получения 7-AQIIK малых концентраций субстрата, обусловленное низкой активностью используемого катализатора, а также малой растворимостью 7-БАДЦК (илк 7-ФАДЦК) в водных растворах с рН 7-8, приводит к сложному методу выделения целевого продукта с исполь зованием органических растворителей (необходимость регенерации растворителей). Использование органических растворителей для выделения 7-AQUK несколько увеличивает выход 7-АДЦК вследствие ее меньшей растворимости в водно-органической среде по сравнению с водной, однако при этом

25 качество выделяемого продукта невысокое.

Цель изобретения — упрощение процесса выделения прокзводнь х 7-амино-3-цефем-карбоновой кислоты и улучшение их качества. Так, прк осуществлении предлагаемого способа получают 7-АДЦК 98-99%-ной чистоты по сравнению с 93 /-нойчистотой

7-АДЦК по известному способу. Кроме того, значительно сокращается как время гидролиза (30-180 мин по предлагаемому спо35 собу по сравнению с 80 час известного способа), так и общее время процесса— час 30мин — 3 часа 30 мин по сравнению со 100 час в противопоставляемом методе.

4О

Это дос тигается тем, что производные

7-амина-3-цефем-4-карбоновой кислоты оошей формулы I где Я- водород, оксиацетил, пиридиний, получают гидролизом производных 7-бен50

=-кл (кли феноксиметил)-ацетамидо 3-цефем-4-карбоновой кислоты формулы Я где Й имеет указанные значения, а Я фенил, феноксиметил. в виде водной суспензии с содержанием

10-100 г/л обычно при рН 6,5 — 8,5, о температуре 2-50 С, который проводят в присутствии деацилирующего фермента из микроорганизма Я..СО1 в водорастворимой или нерастворимой форме, а целевой продукт выделяют из гидролизата при рН-р J в крис» таллической форме.

Способ осуществляют следуюлим образом.

Навеску соединения П суспендируют в воде, устанавливают рН 6,5 8,5, темперао туру — 2-50 С. Б суспензию вводят навес. ку нативного или нерастворимого фермента, В течение гидролиза рН поддерживают на определенном уровне в указанной области, Предельное содержанке субстрата Ограничено растворимостью анионной формы соединений I, которая существенно выше растворкмости соответствующей формы соединений

Ц. Увеличение количества суб" рата (в г/л), взятого для Осущес1вления опыта, приводит к увеличению концентрации продуктов реакции в гидролизатах, что увеличивает

Выход на стадии вьяеленкя целевого " трод ч&та и уменьшает степень расщепления субстрата вследствие кнгибированкя процесса гидро-. лиза продуктами реак wv.

Оптимальный интервал содержания cyocã рата, обеспечивающий накбо. ъшкй суммар.ный выход целевого продукта, существенно меньше предельной растворимости субстрата и составляет 2 0-50 г/л, Для обеспечения практически полного расщепления субстрата в течение 30-180мкн необходимо создать концентрацию фермента в реакционной смеск, равную 2-20 ед/мл.

Навеска нерастворимого фермента„взятого для осуществления опыта, должна составлять не более 3 0% от объема реакционной смеси

В этом случае прк примерно 50%- ком содержании Воды B нерас твори! :cм ферменте потери целевого продукта вследствие его межфазнОГО pGctlределенкя между растворо: : и нерастворимь.м ферментом составляют Около

5% в первом цикле -. Оксло 0,5";. - ИО втором цикле. Следовательно, .Обычно пркь еняемую стадию промывки нерастворимого c»ep:; ента после окончания гкдропиза можно исключить.

Эти требования выполняются, если используемые для гидролиза влажнь;е нерастворимые ферментные препараты к i1еют удельную BK тквность не менее 80 eg /г.

Используемые для расщепления ферментные препараты получают следующим способом.

Клеточн ю био,,, ассу Г C О (, к котор и в качестве антисептика добавлен бутилаце5326 тат, суспендируюг в воде, обраоатывыют раствором полиэлектролита и осаждают активный осадок из фильтра сульфатом аммония, Активный осадок фермента или непосредственно используют для гидролиза соединений формулы 11, или после перевода его в нерастворимую форму. QJIH получения нерастворимой формы фермент сорбируют на катионитах или анионитах. Сорбции фермента на анионитах предшествует его направленная 1О модификация в растворе. Нерастворил1ые ферментные препараты, полученные на основе анионитов, используют для гидролиза более 100 раз. Для получения нерастворимого фермента могут быть также использова- 15 ны приемы ковалентного связывания с носителями разной природы, а также включение и структуру полимера.

Целевой продукт — соединения формулы 1

20 вь деляют из гидролизатов при рН, равном р, в кристаллической фопме

Пример 1. 4 г 7-БАДЦК (12ммопь/ успензируют в200мл воды. К суспензии добавляют 10 мг ферментного препарата с о.. »цим содержанием фермента 700 ед, полученного согласно примеру 5 А. 3а единицу активности фермента принято его количество, которое гидролизует 0,001 М раствор 7-EAlIUK при рН 7,5 и 40 С с З1 образованием 1 мкмоль 7-AlILIK в 1 мин.

Гидролиз 7-EAlIUK проводят при 40оС и автоматическом поддержании рН 7,5 амми ачной водой в течение 60 мин. Полное растворение 7-EAL!UK и постоянство рН раство- у ра свидетельствуют об окончании гидролиза.

Получают 200 мл раствора, содержащего

2,5 r 7-AlIUK. Раствор охлаждают до 56оС и обрабатывают 1 об. % активного ут ля. Уго - отделяют, устанавливают рН раст- 4О вора 3,6-3,7 и после перемешивания в течение 40 мин отделяют кристаллический осадок целевого продукта фильтрацией. Осадок промывают, сушат. Получают 2,3 г

7-AlIUK с содержанием основного вещества, равным 99%. Общий выход 88,5%.

Пример 2. 10 г 7-БАДЦК суспено дируют в 200 мл воды (30,4 ммоль).

Гидролиз проводят в присутствии 10,5 г нерастворимого фермента с активностью )

256 ед/г влажного фермента, полученного

B соответствии с примером 56 при рН7,5 и 20 С, Время гидролиза 90 мин. После отделения фермента получаюг 200 мл раствора с конценграциеи 7-AlIUK 0,146 г. 55

Целевой продукт выделяют аналогично примеру 1. Получают 5,96 г 7-АДЦК 980/-ной чистоты. Общий выход 91%.

При мер 3.6,6 г 7-БАДЦК (20 ммоль) суспендируют в 200 мл воды. g) 19

Гидролиз проводят в присутствии 19,2 г нерастворимого фермента с активностью 1 04 ед/г, полученного B соответствии с примером 5 в, при рН 7,0 и 40 С. Время гидролиза30 мин.

Выделение 7-AlIUK из гидролизата осуществляют путем установления рН, равного

3,5-3,7, Получают 3,85 г кристаллической 7-AQUK. Выход 90,5;oî, содержание основного вещества 99%.

Нерастворимый фермент снова суспендируют с 6,6 r 7-БАДЦК в 200 мл воды, Гидролиз и выделение целевого продукта проводят аналогично описанному. Операцию повторяют 100 раз. Выход 7-AQUK после проведения 100 операций при использовании одного и того же ферл ента составляет 94%.

=одержание целевого вещества 99%.

Пример 4. 5 г 7-ФДАЦК (14,5 ммоль) суспендируют B 200 мл воды в присутствии 10 г нерастворимого фермента, полученного по примеру 56. Гидроо лиз проводят рН 7,5 и 40 С в течение

180 мин. Выделяют 7-АДЦК изгидролизага аналогично примеру 3. Получают 2,72 г

7-АДЦК 98%-ной чистоты.

Пример 5.

A. Получение BoIIopaci.BopHI oго фермента.

0,5 кг влажной биол ассы с содержанием сухих ве.т еств около 20% и акгпвностью

1,17 10 ед суспендируют в 1 л воды с добавлением 5 о6.% бутилацетата. Суспено, зию выдермя1вают при рН 7,0 н 40 в течение 3 час. Загел1 реакционную л .ассу о охлаждают до 3-5 С и обрабать-вают раствором полиэлектролита RA-2 (200 мл

2 /-ного рас Bopa). После lisper",ешивания в течение 5-10 мин водный экстракт отделяют от сфлоккулированной клеточной массы.

К филь трат добавляют су-льфаг алел;ония

IIo 40% HGOI» .щения. После отделения 6GJIJIBc 1 ных белков концентрацию сульфата аммония доводят до 60% и о-,деляют активный осадок. Активный осадок, содержащий примерно 60% влаги, высушивают при 40 С в вакууме. Получают 800 мг ферл:енгного

4 препарата с активностью 0,93-10 ед. Удельная активность полученного препарата

7,5 ед/мг белка, Выход фермента 79%.

Б. Получение высокоочищенного водорастворимого фермента.

Активный осадок, содержащий 0„93 -10ед фермента, растворяют в 450 мл 0,01 М фосфатного буфера, рН 7,0-7,5. К раствору фермента добавляют полиэтиленгликоль с мол. м. 4000-6000 в количестве 20% от объема, после отделения балластных белков концентрацию полиэтиленгликоля доводят до 35%. Активный осадок растворяют в

5326 кацию. нгх LГ

CH2R

СООН

Тираж 575

Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Улаород, ул. Проектная, 4

350 мл 0,01 М фосфатного буфера, рН5,8.

Сорбцию фермента из раствора проводят в течение 3 час в статических условияхКМ-сефадексом, предварительно уравновешенным

0,01 М фосфатным буфером, рН 5,8. Qecop6g цию проводят 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,5, содержащим 0,3 н. хлористый натрий. Получают 300 мл элюата, содержащего

0,65 10 ед. фермента. Выход 56%. Удельная активность полученного препарата — )О

40 ед /мг.

В. Получение нерастворимого фермента сорбцией на катионитах.

300 мг активного осадка (пример 5 А) растворяют в 1,0 л 0,01 М фосфатного бу- l5 фера с рН 5,8. К раствору добавляют 13 г карбоксильного катионита КБ-2-0,5, зернение 0,25-0,5 мм, который предварительно приводят в равновесие с тем же буферным раствором, Общее количество фермента, 3 взятого на сорбцию, равно 3,5 10 ед. Сорбо цию ведут при 5 С в течение суток при перемешивании. Затем катионит отделяют от раствора и промывают водой. Получают12г влажного нерастворимого фермента с активностью 256 ед/г, общее содержание активного фермента 3,1 10 ед, т. е, 89% от взятого на связывание, Г. Получение нерастворимого фермента сорбцией на анионитах.

К 10 г сильноосновного анионита Амбер» лита ЗЙА-938, приведенного в равновесие с 0,01 М фосфатным буфером с рН 7,5 добавляют 30 мл модифицированного фермента и 170 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7 5. Общее содержание фермента, взяt

° Ъ того на сорбцию, равно 1,5 10 ед. Сорбцию ведут в течение суток при перемешивании (5 С). Смолу затем отфильтровывают, промывают 200 мл 1 М ЙаС (дважды), а затем буфером и водой. Получают 9,6 r влажного нерастворимого ферментного препарата с активностью 104 ед/г, всего

1000 ед., т. е. 67% от активности, взятой на связывание, Максимум каталитической активности полученного ферментного препарата смещен в кислую область (pH 6,87,0). Время полураспада равно 600 час (pH 7,0), что позволяет использовать дан ный ферментный препарат около 200 раэ.

Направленную модификацию растворимо»

ro ферментного препарата, предшествующую его сорбции на анионитах, проводят следу- М юшим образом.

ЦНИИПИ Заказ 5464/185

19

К 75 мл ферментного раствора (пример

5 б) с общей активностью 1,62 ° 10 ед.

3 добавляют 50 мг ярк<голубого активного дихлортриазинового красителя. Раствор вью держивают в течение 2 час. при 28 С, а затем избыток несвязавшегося красителя отделяют на колонке с сефадексом g- 25.

Получают 75 мл раствора модифицированного фермента, содержащего 1,55 10 ед., т. е. 96% от активности, взятой на модифи—

Формула изобретения

1. Способ получения производных7-амино-3-цефем-4-карбоновой кислоты общей формуль1 I где R — водород, оксиацетил, пиридиний, ферментативным гидролизсм 7-бенэил(или феноксиметил)-ацетамидо-3-цефем-4-карбоновой кислоты общей формулы Й

l где R имеет укаэанные значения, а Я фенил,:реноксиметил при температуре до

50оС, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения качества продуктов, гидролиз прогодят в присутствии деацилируюшего фермента иэ

Х-COEj а целевой продукт выделяют из гидролизата при pH=p .1в кристаллической форме.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю ш и й» с я тем, что процесс ведут при 2-50 С.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент Англии № 1119806, кл.

С 2 А, 1968.

2, Патент Англии М 957569, кл. С 2 А, 1964.

3. Патент ГЙР ¹ 97213, кл. 12 р4/04, 1973.

4. Патент Англии ¹ 1369970, кл.

С 2 А, 1974.