Способ получения молокосвертывающего фермента

Способ получения молокосвертывающего фермента

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

536 757 тельную среду добавляют агар в предварлтельно стерилизованную водную питательную среду, содержащую глюкозу, экстракт дрожжеЛ, гидролизат протеина, минеральные соли и гематин, при этом последний добавляют после стерилизации водной среды. В указанную питательную среду вносят микроорганизмы7llvsarum pofvce)balue, заливают в чашки Петри и выдерживают при 25оС.

Культура развивается в течение несколь- ких дней, покрывает поверхность чашек

Петри и остается в форме плазмодия в течение 7 дней до появления склеротия.

Выращивание на поверхности осуществляют также на фильтровальной бумаге, питае15 мой жидкой питательной средой, с помощью капилляров.

В случае роста микроорганизмов в погруженном cocToÿíèè микроорганизмы РИ f5cl"

l um pof,чСЕрЪС 1цтп имеют вид плазмодия, разделенного на мелкие частички (микроплазмодий) и находящегося в питательной водной среде во взвешенном состоянии.

В случае выращивания в колбе в последнюю вводят предварительно стерилизованную питательную среду, затем вносят плазмодий, полученный из культуры на поверхности или из культуры в погруженном состоянии. Выращивание проводят при 25оС при встряхива- Зг нии колбы для насыщения микроорганизма кислородом.

После скрытой фазы, которая длится l 2 час, если инокуляцию осуществляют в погруженном состоянии, или 2-3 дня, если ино- Зк куляцию осуществляют на поверхности с помощью агара, клетки достигают своих максимальных размеров через 3 дня.

В случае использования бродильного чана в погруженных условиях разведения в последний вводят жидкую питательную среду и стерилизуют, при этом глюкозу вводят только после стерилизации других компонентов чана. Из погруженной среды берут посев и вводят в бродильный чан. который вы-4 держивают при температуре роста микроорг анпзма, например при 25 о С, Разведение проводят при перамешивании с помощью смесителя со скоростью, достаточной для нор— мального обеспечивания питательной среды Эъ кислородом.

Получаемый протеолитический фермент, свертывающий молоко, выделяют из водного раствора при выращивании на поверхности путем промывки микроорганизма солевым 5g раствором хлористого натрия, содержащим

9,0 г КаС на 1 л воды.

При выращивании в колбе или бродильном чане фермент выделяют путем декантации, фильтрацииили центрифугирования с по- р

1,0;

0,06;

0,06; следующим сбором остаточного водного раствора, содержащего фермент. Воцный раствор фермента подвергают медленному замораживанию, затвердевшую фазу отделяют и собирают остаточную жидкость путем смешивания ее с буферным раствором, рН которого способствует активности протолитического фермента.

Для получения чистого продукта протеолитический фермент отделяют от концентрированного раствора путем осаждения, для чего готовят новый водный раствор этих протеинов и разделяют его хроматографи— ческим методом.

Получаемый фермент разрушает фенилаланиново — метиониновую связь пептидной цепи каппа-казеина, оказывая на молоко коагулирующее действие.

Пример 1. Культуру выращивают в погруженном состоянии из микроорганизмовР hwsolrum yoKwceplolf,um, полученного в

Швейцарском научно-исследовательском институте рака (Лозанна, Швейцария) в 15 л бродильном чане, на питательной среде состава, вес. %:

Глюкоза 1,0;

Экстракт дрожжей 0,15;

Гидролизат казеина (триптон)

СаСЮ 2 2Н20

КН Р04 0,2;

Xg 50 7Н О

Fe CO 2 ° 4Н20 О, 006;

МпС8 . 4Н О О, 0085;

7Н О ф

О, 0035;

Лимонная кислота 0,35;

Гематин 0,0005;

Вода (водопроводная) Баланс до 100%, В бродильный чан вводят 8 л водного раствора указанной питательной среды (кроме глюкозы и гематина). Раствор стерилизуют, подогревая его до 121оС под давлением в течение 15 мин. Глюкозу растворяют в воде из расчета 50 r на 1 л и стерилизуют. Затем раствор в бродильном чане охлаждают до 25оС и в чан вводят стерильный водный раствор глюкозы, устанавливают рН смеси 4,5 водным раствором едкого натрия, а затем добавляют гематин, предварительно стерилизованный при 120оС в течение 15 мин в водном щелочном растворе.

После этого в питательную среду вносят 2 л посеВа, полученного путем выращивания в колбах в погруженном состоянии в течение 2 дней микроплазмодия Р hv sar uòï романсе рЪа цтл.

Питательную среду перемешивают мешалкой

536757 и а-к азеи н.

ЦНИИПИ Заказ 5766/270 Тираж 575

Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 со скоростью вращения 150 об/мин для обеспечения среды кислородом и выдерживают при 25оС Выращивание микроорганизма проводят 20 час, получая бульон для культуры микробов, содержащий в сухом виде

1 вес.% клеточного вещества.

Микроплазмодий l Ü ÑÕI um рОЬСЕ рйа Сцтп отделяют от водной питательной среды центрифугированием и собирают вспль:вшее на поверхность вещество, после чего измеря- 1О ют протеолитическую активность всплывшего продукта по методу "Азоколь".

Метод "Азоколь" заключается в воздействии раствора, протеолитическую активность | которого измеряют на субстрат ("Азоколь"), состоящий из нерастворимого порошка, изготовленного из кожи коровы, и содержащий ярко-красный краситель. Субстрат "Азоколь" суспендируют в 0,05 М буферном растворе ро ацетета при рН 4,5 из расчета 25 мг "Азоколя" на 5 мл буферного раствора. Всплывающее вещество добавляют в количестве, заданном для этой суспензии; смесь выдерживают при 37оС 15 мин, затем субстрат удаляют фильтрацией и измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 510 нм.

Измеряемую по этому методу единицу 30 активности определяют как количество всплывающего на поверхность вещества, вызывающего увеличение оптической плотности единицы. Протеолитическая активность всплывающего вещества составляет 0,7 ед/мл.

Полученный продукт имеет следующие характеристики, Максимальная протеолитическая активность проявляется при рН 4.,0 — 5,0 и уменьшается на 15% от максимальной при рН 7. 4О

Протеолитическая активность постоянна при 0-30оС, а затем уменьшается и при

60оС практически равна нулю, Коагулирующее действие на молоко: смесь при 37оС, имекшая рев1-.ые обьемы всплывающего вещества и снятого молока и содержащая 12% твердых веществ, вызывает свертывание молока за 10 мин.

Пример 2. Всплывающее на поверх-к ность вещество, полученное в примере 1, концентрируют путем замораживания, для чего его охлаждают, вызывая затвердевание.

Незамерзшую фракцию собирают, смешивают с 0,05 М ацетатным буферным раствором, имеющим рН 4,5 и получеют 1,5 л KDHLентрированного раствора с протеолитпческой активностью, измеренной по методу "Азоколь" аналогично примеру 1, составляющей

3,5 ед/мл.

Затем осаждают протеины из IfoIIL eEIrpII— рованного раствора сульфатом аммония If образовавшийся осадок отделяют центрифугированием. Осадок растворяют в 0,05 М ацетатном буферном растворе при рН 4,5 и диализуют этот раствор 24 час or этого буферного раствора.

Полученный раствор фракциониру-ют с помощью хроматографии путем прохождения через колонну диэтиламино-этилцеллюлозы, уравновешивают 0,05 М ацетатным буферным раствором, содержащих: хлорид Ifr pffft, децинормальной концентрации. Элюпрован ..:фермента выражается тремя лпкамп кнте:— сивной протее..итической активноеri.. Фракции, соответствующие этим пикам, ссбпра1от, Далее сравнива1от действие peEIs;II;e;1 каждой из элюпрованных фракций на каппаказеин, причем при добавлении карбоксипептидазы А фенилаланин освобождается и можно определить его количество. Однако добавление только карбоксипептидазы не вызывеег выделения фенилеланина.

Таким образом, действие реннпн» сход Ic с действием получаемого фер.1ент не к».,—

Формула изобретения

Способ получения молокосвертывающего фермента путем культивирования мпкроорганизмсв, продуцирующих фермент, не питательной среде, содержащей источники у Г— лерода, азота и минеральные соли, в аэробHbIx ycrfoâIIÿõ с пос7елующп. .; выделенпем фермент-1 из . той среды, о т 7 и ч ., lо ц и йс я тем. что B "ачестве 1.!икp )opT «н11з . ов. продуцирующпх молокосвертыва1О1 -.-:; .коммент, пспольт;ют PH.YsoiI Uè роЬсе Ъа(цтп.

I 1

2. Способ ло п.1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что из микроорганизмов Ь &ои <тп

pofvcepNafum используют штамм 491.61.

Источники информации, принятые во вни— мание при экспертизе:

1. Патент Англии Лс 177705.-1.:;7 СЗН3, от 07. 01. 1970 г.