Способ удаления пирогенных веществ из -аспарагиназы

Способ удаления пирогенных веществ из -аспарагиназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ToHvH0-тсх ч!исси@ библиотеки МБА

ОП ИГРАНИ Е ц3ОБРЕТЕ Н И Я п1) 537!!4

Сове Советских, Социалистических республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 02.09.74 (21) 2058867/13 с присоединением заявки № (51) М. Кл.2 С 12D 13/10//

С 07G 7/02

Совета екинистрав СССР по лелем изобретений и открытий

Опубликовано 30.11.76. Бюллетень № 44

Дата опубликования описания 22.12.76 (53) УДК 615.779.94 (088.8) (72) Авторы изобретения

Г. И. Клейнер, P. А. Жагат, Л. В. Пояркова, Л. М. Елизаровская, Д. Я. Дайя и И. К. Звиргзда-Звиргздиня

Ордена Трудового Красного Знамени институт органического синтеза

АН Латвийской ССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ УДАЛЕНИЯ ПИРОГЕННЫХ ВЕЩЕСТВ

ИЗ Е-АСПАРАГИНАЗЫ

Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к получению препаратов, которые могут найти применение при лечении злокачественной болезни крови— лей козы, Известен способ удаления пирогенных веществ из L-аспарагиназы путем сорбирования аминоалкилированными гелями декстрана и разделения хроматографией (1).

Известен способ очистки аспарагиназы, заключающийся в том, что раствор сырца подвергают фракционированию полиэтиленгликолем, осажденный фермент растворяют в воде и осаждают целевой продукт спиртами. Осаждение ведут в присутствии полиэтиленгликоля.

Кристаллизацию осуществляют, например, при рН 5,2 (2).

Однако известный способ не обеспечивает полного удаления пирогенных веществ.

С целью более полного удаления пирогенных веществ сырец фермента растворяют в воде при рН 5,2 — 5,6 и полученный раствор непосредственно фракционируют полиэтиленгликолем, выпавший осадок растворяют и целевой продукт кристаллизуют полиэтиленгликолем и изопропиловым спиртом. Для кристаллизации используют полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 в количестве 0,9 — 2,2% и изопропиловый спирт в количестве 9 — 12% (по объему), а в качестве исходного полуфабГосУдаРственный комитет (23) Пр„оритет риката берут сырец фермента, содержащий не менее 50 МЕ/мг белка.

П р имер 1. 5 r лиофилизированного сыр- ца L-аспарагиназы с удельной активностью

72 МЕ/мг белка растворяют в 70 мл апирогенной воды, подкисляют до рН 5,2 — 5,4 2 М уксусной кислотой, охлаждают до 2 — 5 С и добавляют при перемешивании 50%-ный водный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) молекулярного веса 1500 до 5% -ного содержания.

После 10,мин выдержки раствор центрифугируют в течение 20 мин при 5000 об/мин и осадок отбрасывают. К надосадочной жидкости добавляют 50% -ный раствор ПЭГ до 10%, осадок отделяют центрифугированием при

5000 об/мин в течение 20 мин, растворяют его в апирогенной воде до концентрации белка

35 — 40 мг/мл, подщелачивают до рН 6,5 — 7,0 и нерастворимую часть центрифугируют.

Полученные 45,8 мл раствора с удельной активностью 172 МЕ/мг белка подкисляют до рН

5,2 — 5,5 0,5 М уксусной кислотой, добавляют при перемешивании 50%-ный водный раствор

Л ПЭГ молекулярного веса 6000 до 0,7%, изопропиловый спирт до 5% и выдерживают

18 — 20 час при 2 — 5 С. Выпавший кристаллический осадок отделяют центрифугированием в течение 20 мин при 5000 об/мин, растворяют

30 в воде до содержания белка 35 — 40 мг/мл, ус537114

Таблица 1

Удельная активность фермента, МЕ/мг белка

Пирогенность при введении

1000 МЕ/мг веса кролика

Выход фермента, д от исходного

Выход по белку 0 от исходного

Всего белка, мг

Всего

МЕ, 1Р3

Объект исследования

2,0

1,6

1,0

0,3

0,3

1,8

1,4

0,6

0,2

0,2

1,8

1,2

0,5

0,5

0,2

72,5

172

200

348

273

144

74

54,7

79

41,3

21,2

15,7

100

16,7

8,3

5,7

273

Исходный материал

Фракция

Первая кристаллизация

Вторая кристаллизация

Третья кристаллизация

Таблица

Пирогенность при введении

1000 МЕ/г веса кролика

Удельная активность фермента, МЕ/мг белка

Выход фермента, от исходного

Выход по белку, % от исходного

Всего белку, мг

Всего

МЕ, 10З

Объект исследования

1,7

0,9

0,9

0,3

0,1

1,6

1,2

0,8

0,1

0,2

1,8

1,2

0,7

0,5

0,2

177

205

85,5

66,0

34,0

25,0

632

676

522

268

197

Исходный материал

Фракция

Первая кристаллизация

Вторая кристаллизация

Третья кристаллизация

100

35,7

18,7

8,5

4,0 танавливают рН 6,5 — 7,0 и снова центрифугируют. Получают 17,8 мл раствора с удельной активностью 180 МЕ/мг белка.

Аналогичным образом проводят вторую кристаллизацию. Получают 9,7 мл раствора

L-аспарагиназы с удельной активностью

185 МЕ/мг белка. После третьей кристаллизации получают 2,64 мл раствора с удельной активностью 200 МЕ/мг белка.

Проводят испытание на пирогенность. ПриПример 2. 20 r лиофилизированного сырца L-аспарагиназы с удельной активностью

50 ME/мг белка растворяют в 230 мл апирогенной воды, подкисляют до рН 5,2 — 5,4, охлаждают и фракционируют раствором ПЭГ молекулярного веса 1500 как указано в примере 1. Осадок, выпадающий при концентрации ПЭГ 5 — 10 /О, растворяют и центрифугируют. Получают 173 мл раствора с удельной активностью 120 МЕ/мг белка. Проводят последовательно первую, вторую и третью кристаллизации аналогично примеру 1, с той разПример 3. 20 г лиофилизированного сырца L-аспаратиназы с удельной активностью

82 МЕ/мг белка растворяют в 230 мл воды и фракционируют водным раствором ПЭГ молекулярного веса 1500 аналогично примеру 1.

Осадок, выпадающий при концентрации ПЭГ

5 — 10%, растворяют и центрифугируют. Получают 197 мл раствора с удельной активностью

170 МЕ/мг белка, Кристаллизацию проводят как в примере 1, с той разницей, что вносят

4 нятая тест-доза равняется 1000 МЕ на кг веса кролика.

Раствор L-аспарагиназы, полученный растворителем кристаллического вещества в воде, разводят до концентрации 1000 МЕ/мл, вносят в качестве стабилизатора глицин в количестве 18,9 мг/мл, отфильтровывают через мембранный фильтр и лиофилизируют, Результаты испытания на пирогенн ость

10 представлены в табл. 1. ницей, что вносят каждый раз 50 /О-ный раствор ПЭГ молекулярного веса 6000 до 1а/а, а изопропиловый спирт — до 100/О.

После первой кристаллизации получают

86 мл раствора с удельной активностью

177 МЕ/мг белка. После второй кристаллизации получают 4,2 мл раствора с удельной активностью 200 МЕ/мг белка, после третьей кристаллизации раствор имеет удельную ак20 тивность 205 МЕ/мг белка.

Результаты испытания на пирогенность представлены в табл. 2. каждый раз 50%-ный раствор ПЭГ молекулярного веса 6000 до 1,5%, изопропиловый спирт до 15%. После первой кристаллизации получают 93 мл раствора с удельной активностью 180 МЕ/мг белка. После второй кристаллизации препарат имеет удельную активность 170 МЕ/мг белка, после третьей кристаллизации — 180 МЕ/мг.

Результаты испытания на пирогенность представлены в табл. 3.

537114

Таблица 3

Удельная активность фермента, МЕ/мг белка

Пирогенность при введении

1000 МЕ/мг веса кролика

Выход фермента, от исходного

Выход по белку, от исходно-! го

Всего белка, мг

Всего

МЕ, 10

Объект исследования

1,8

1,4

0,8

0,8

0,1

1,7

1,2

0,7

0,6

0,4

97

57,8

35,1

21,2

1148

688

418

252

82

180

100

263

9,7

1,4

1,1

1,1

0,5

0,2

1400

Исходный материал

Фракция

Первая кристаллизация

Вторая кристаллизация

Третья кристаллизация

Таблица 4

Удельная активность фермента, МЕ/мг белка

Пирогениость при введении

1000 МЕ/мг веса кролика

Выход фермента, от исходного

Выход по белку, от исходного

Всего белка, мг

Всего

МЕ 10з

Объект исследования

Исходный материал

Фракция

Первая кристаллизация

Вторая кристаллизация

Третья кристаллизация

222

34

24,8

16,9

10,1

64

49,6

33,6

19,2

2,0

1,6

0,9

0,8

0,5

1,9

1,7

1,0

0,8

0,6

200

1,7

1,4

1,3

0,7

0,4

1100

Пример 4. 20 r лиофилизированного сырца L-аспарагиназы с удельной активностью

110 МЕ/мг белка растворяют в 230 мл воды и фракционируют водным раствором ПЭГ .молекулярного веса 1500 аналогично примеру 1.

Осадок, выпадающий при концентрации

ПЭГ 5 — 10% растворяют, нерастворимую часть отделяют центрифугированием. Получают 175 мл раствора с удельной активностью

200 МЕ/мг белка. Проводят три последовательные кристаллизации как в примере 1, с

Предлагаемый способ обеспечивает возможность получения противолейкозного лекарственного средства L-аспарагиназы.

Формула изобретения

1. Способ удаления пирогенных веществ из

L- аспарагиназы микробного происхождения путем фракционирования сырца фермента IIOлиэтиленгликолем, отл и ч а ю щи и с я тем, что, с целью более полного удаления пирогенных веществ, сырец фермента растворяют в воде при рН 5,2 — 56 и полученный раствор непосредственно фракционируют полиэтиленгликолем, выпавший осадок растворяют и целевой продукт кристаллизуют полиэтиленгликолем и изопропиловым спиртом, той разницей, что вносят каждый раз 50%-ный раствор ПЭГ молекулярного веса 6000 до

2,2 /о, изопропиловый спирт — до 10 /о, а кристаллический осадок первой, второй и третьей кристаллизации дважды промывают двойным объемом ацетона и высушивают до постоянного веса в вакуум-сушильном шкафу при температуре 40 С и остаточном давлении 30—

40 мм рт. ст.

Результаты испытания на пирогенность представлены в табл. 4.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для кристаллизации используют полиэтиленгликоль с,молекулярным весом 6000 в количестве 0,9 — 2,2/о и изопропиловый спирт в количестве 9 — 12 /о (по объему).

3. Способ по п. 1 — 2, отличающийся тем, что в качестве исходного полуфабриката используют:сырец фермента, содержащий не менее 50 МЕ на мг белка.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент США № 3634196, кл. 195 — 66а, 25 1973 (аналог).

2. Патент Франции № 1598881, кл. С 07G

7/02, 1970 (прототип).