Способ выделения эндонуклеазы

Способ выделения эндонуклеазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ЭНДОНУК- ЛЕАЗЫ из культуральной жидкости Serratia marcescens путем осаждения сульфатом аммония с последующей хроматографической очисткой, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и его степени чистоты, хроматографию осуществляют на полистироль ной анионообменной смоле типа АН 17.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) 3(Я) С 12 Н 9/10

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHGMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21 ) 1780634/13 (22) 03.05,72 (46) 30.01.84. Бюл. Р 4 (72) О.И. Полидорова, P.È. Салганик, Л.П. Сенженко и В.К. Старостина (71) Специальное конструкторско"технологическое бюро биологически активных веществ (53) 615.779.94 (088.8) I (54) (57) СПОСОБ В6ЩЕЛЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕА36) из культуральной жидкости

Serratia rnarcescens путем осаждения сульфатом аммония с последующей хроматографической очисткой, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и его степени чистоты, хроматографию осуществляют на полистирольной анионообменной смоле типа АВ 17. г

537512

Редактор 3. Бородкина Техред A.Áàáèíåö Корректор А. Зимокосов о

Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 1065/3

Филиал ППП "Патент", r Ужгород, ул. Проектная,4

Изобретение относится к биологии, а именно к способам получения ферментных препаратов.

Известен способ получения эндонуклеазы, заключающийся в том, что целевой продукт высаливают иэ куль- 5 туральной жидкости Serratia marcescens с помощью сульфата аммония с последующими хроматографией раствора на смоле Амберлит РЯС=50, обессоливанием на биогеле Р-6, хро- fp матографией на смоле Сефадекс A-50 и концентрированием раствора фермента.

С целью повышения выхода целевого продукта и его степени чистоты хроматографию осуществляют на полистирольной анионообменной смоле типа AB 17.

Способ выделения и очистки эндонуклеазы из культуральной жидкости

Serratia marcescens штамма В 10М1 и 10 осуществляют следующим образом.

Выращивание проводят по известной методике. Для этого 2 л культуральной жидкости, содержащей

300 ед. акт./мл эндонуклеазы (за единицу активности эндонуклеазы принимают прирост оптической плотности в кислоторастворимой фракции ца 1 единицу оптической плотности, измеренной при 260 нм, за 20 мин 30 при 37 C), 0,1-0,2% от активности эндонуклеазы ФМЭ и 1-23 от активности эндонуклеазы ФДЭ, центрифугируют, к супернатанту добавляют (NHq)> ЯО до 40Ъ насыщения и смесь 35 снова центрифугируют. Осадок отбрасывают, к супернатанту добавляют (МНц) $0, до 80% насыщения и смесь центрифугируют. Осадок собирают и растворяют его в 30 мл 0,05 М трис-HCR рН 8,2, 0,005 М MgCIg .

Затем раствор фермента центрифугируют, нерастворимый осадок отбрасывают. Выход эндонуклеаэы по активности составляет 80-90%. !

Супернатант, содержащий около 3 г белка, 5000000 ед.акт. эндонуклеазы, 0,1% ФМЭ и 0,2-0;5% ФДЭ, наносят на колонку с анионообменной смолой

AB 17x2 в фосфатной форме, уравновешенную 0,01 М Na-фосфатным буфером, рН 7,5. Фермент не сорбируется на смоле и элюируется 0,01 М Na-фосфатным буфером, рН 7,5, в объеме

500 мл. Пигменты, балластные белки, а также фосфатаза и фосфодиэстераза задерживаются на анионообменнике.

Выход фермента по активности составляет 80-90%.

Раствор фермента концентрируют при упаривании на ротационном испарителе при 30 С до объема 100 мл.

В результате очистки получают раствор фермента, содержащий около

100 мг белка, 4000000 ед.акт, эндонуклеаэы, около 0,01% ФДЭ и не более 0,001% ФМЭ. Общий выход фермента по активности составляет 60-70%.

В ходе очистки активность фосфатазы и фосфодиэстеразы уменьшается в

100 раз.