Способ получения водонерастворимого препарата фермента

Способ получения водонерастворимого препарата фермента

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

уат Внтт. о; опь с- иЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

tt t, 53763О

Союз Советских

Социалистическкх

Реслублик

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (51) М. Кл. - С 076 7/02 (22) Заявлено 27.03.73 (21) 1898251/13 (23) Приоритет — (32) 30.03.72 (31) P 2215539.1 (33) ФРГ

Опубликовано 30.11,76. Бюллетень № 44

Государственный комитет

Совета Министров СССР ло делам изобретений н открытий (53) УДК 615.779.94 (088.8) Дата опубликования описания 15.12.76 (72) Авторы изобретения Иностранцы

Фритц Хюпер, Эрих Рауенбуш, Гюнтер Шмидт-Кастнер, Бруно Бемер и Херберт Бартл (ФРГ) (71) Заявитель Иностранная фирма

«Байер АГ» (ФРГ) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

ВОДОНЕРАСТВОРИМОГО ПРЕПАРАТА ФЕРМЕНТА

Изобретение относится к получению новых нерастворимых в воде протепповых препаратов.

Извсстен способ получения нерастворимых в воде протепповых препаратов, согласно которому водный раствор протеина смешивают с водной суспензией полимера, полученного полимеризацией сополимеров, с последующей промывкой и отделением нерастворимого в воде протеинового препарата (1).

Однако такой способ не обеспечивает получения стабильного препарата пенициллинацилазы.

С целью устранения указанного недостатка по предлагаемому способу фермент подвергают контакту с сополимером и, р-моноолефиноненасыщенпого ангидрида дикарбоновой кислоты с 4 — 9 атомами углерода и ди- и/или полиметакрилата ди- и/или полиолов при рН

5,7 — 6,8 и температуре 0 — 30 С.

В качестве а, Р-моноолефиновых ненасыщенных ангидридов дикарбоновых кислот с

4 — 9 атомами углерода, которые используют для приготовления сополимеризатов, применяют ангидриды малеиновой, итаконовой или цитраконовой кислот, в основном ангидрид малеиновой кислоты. Для сополимеризации можно применять смеси этих ангидридов.

Применяемые ди- ii/или полиметакрилаты или ди- и/или полиакрилаты двухатомных и/или многоатомных спиртов получают из соединений с двумя спиртовымп или фенольпы5 ми группами, предпочтительно, спиртовыми

ОН-группами, или продуктами их взаимодействия с алкиленоксидами с 2 — 8 атомамп углерода, предпочтительно 2 — 4 атомами углерода, или смесями этих алкиленоксидов;

10 причем на 1 моль соединения, имеющего гидроксильные группы, полимеризуется 1 — 10, предпочтительно 1 — 20, алкиленоксидных единиц.

Применяют следующие алкиленоксиды:

15 этиленоксид, пропиленоксид, бутиленоксид, триметиленоксид, тетраметиленоксид, бисхлорметилоксациклобутан, стиролоксид, предпочтительно этиленоксид и пропиленоксид.

Также вполне можно применять продукты

20 взаимодействия соединений по меньшей мере с двумя активными по Цервитинову атомами водорода, которые происходят не от спиртов пли фенолов, с вышеназванными алкиленоксидами для приготовления ди- и/илп полпмет25 акрплатов.

Применяемые ди- и полиметакрилаты двухатомных и многоатомных спиртов получают по известным методам.

537630

В качестве двухатомных или многоатомных спиртов по меньшей мере с двумя атомами углерода, предпочтительно с 2 — 12 атомами, используют: этилепгликоль, пропандиол-1,2, пропандиол-1,3, бутадиолы, в особенности бутандиол 1,4, гександиолы, декандиолы, глицерин, триметилолпропан, пентаэритрит, сорбит, sucrose и их продукты взаимодействия с алкилепоксидами. Используют также полибисхлормстплоксациклобутан нлп полистпролоксид, смеси двухатомных и многоатомных спиртов.

Предпочтительно применяют диакрилаты или диметакрилаты двухатомных спиртов с

2 — 4 атомами углерода и/или продукты взаимодействия одного моля этих двухатомпых спиртов с 1 — 20 молями алкиленоксида с 2—

4 атомами углерода или триметилолпропантриметакрилат, а также диметакрилаты этиленгликоля, диэтиленгликоля, триэтиленгликоля, тетраэтиленгликоля или высших полиэтиленгликолей с молекулярными весами до

1000 или их смеси.

Наряду с применяемыми ди- и/или полиметакрилатами добавляют также обычно применяемое средство сшивки Ilo меньшей мере с 2-мя пеконъюгированными двойными связями, например, дивиниладинат, метиленбисакриламнд, триакрилформаль или триаллилцианурат, в количествах 0,01 — 30 вес. /ц по отношению к мономерной смеси.

Полимеризацию осуществляют в органическом растворителе как осадительную, причем полимеры начинают осаждаться после начала полимеризации. Пригодными являются все растворители, инертные по отношению к апгидридным группам. Оптимальные растворители — алифатические, циклоалифатические или ароматические углеводороды, а также галоидзамещенные углеводороды, алкилароматические углеводороды или сложные эфиры карбоновых кислот. В качестве примеров следует назвать: гептан, октан, изооктан, бензиновые фракции с точками кипения от 60 до

200 С, циклогексан, бензол, толуол, ксилол, хлорбензол, дпхлорбензолы, этилацетат, бутилацетат.

Растворители должны иметь точку кипения по меньшей мере 60 С и хорошо удаляться в вакууме из осажденного полимеризата. Для одной части мономерной смеси применяют примерно 2 — 50, предпочтительно 5 — 20вес.ч. растворителя. На свойства сополимеризата, особенно насыпной вес и удельную поверхность, значительно влияют род и количество растворителя.

В процессе полимеризации непрерывно добавляют осадитель для полимера. Осадитель можно также добавлять в определенные моменты времени в одну или несколько порций.

Мономерную смесь вместе с пригодным инициатором в виде раствора или без растворителя можно поглощать в указанном количестве растворителя, так что во время полимернзации прямо получается равномерная моно5

60 б5 мерная концентрация. Путем применения метакриловых мономеров с различной гидро-, фильностью и путем изменения условий полимеризации приготавливают продукты с приспособленной к цели применения набухаемостью, плотностью и удельной поверхностью при хорошей механической стабильности.

Сополимеризаты можно также приготавливать путем суспензионной полимеризации.

Применяют вид бисерной полимеризации, при которой мопомеры, в известных условиях, при добавке органического растворителя суспендируются в воде. Поэтому суспензионную полимеризацию целесообразно проводить в органической среде. Мономеры и инициатор растворяются в не смешиваемом с парафинами, инертном по отношению к ангидридным группам растворителе, как ацетонитрил, диметилформамид, диметилсульфоксид или триамид гексаметилфосфорной кислоты, распределяются при добавке диспергаторов.

В качестве связующей фазы применяют парафиновые углеводороды, как гексан, гептан, октан и высшие гомологи циклоалифатическпх углеводородов, как циклогексан, а также смеси парафиновых углеводородов, как бензиновые фракции или парафиновые масла.

Объемное соотношение связующая фаза: мономерная фаза составляет 1:1 — 10:1, предпочтительноо 2: 1 — 5: 1.

Для стабилизации суспепзии применяют глицерин-моно- и диолеаты, а также смеси этих соединений, сорбитан моно- и триолеаты или стеараты, простой моноэфир полиэтиленглпколя со стеариловым или лауриловым спиртом или нонилфснолом, сложный моноэфир полиэтиленгликоля с олеиновой, стеариновой и другими кислотами жирного ряда с более чем 10 С-атомами, а также Na-соль сложного дноктилового эфира сульфоянтарной кислоты. Эти вещества применяют в количествах, предпочтительно, 0,1 — 10 / по отношению к мономерной смеси, растворяют в углеводородной фазе. Величина частиц суспендированного полимеризата может уменьшаться за счет увеличения скорости перемешивания, путем добавки 0,1 — 2/o по отношению к мономерам другого поверхностно-активного вещества, например алкилсульфоната.

Полимеризацию вызывают радикальными инициаторами. Пригодными инициаторами являются, например, азосоедннення или перекпсные соединения. Пригодным азосоединением для возбуждения полимеризации является нитрил азоизомасляной кислоты. В качестве перекисных соединений применяют диацилперекиси, как перекись дибензоила или перкарбонаты, как диизопропил и дициклогексилперкарбонат, Ilo можно также применять для инициирования диалкилперекиси, гидроперекиси и активные в органических растворителях окислительно-восстановительные системы.

Ишщиаторы применяют в количествах

0,01 — 10 /?, предпочтит тьно 0,1 — 3 /, по от537630

65 ношению к общему количеству мономерной смеси.

Полимеризацию осуществляют при температурах -20 †2 С, предпочтительно 50—

100 С, в зависимости от скорости разложения инициаторов и ниже точки кипения растворителя, а при бисерной полимеризации — ниже температуры смешения обеих фаз. Полимеризовать можно в инертной атмосфере и в отсутствии кислорода.

Сополимеризаты, полученные путем осадительной полимеризации, от бесцветного до слабо-желтого цвета, порошкообразные вещества с насыпным объемом 1,5 — 30 мг/г, предпочтительно 2 — 20 мл/г, и удельными поверхностями 0,1 — 500 м /г, предпочтительно 1—

400 м /г. Содержание карбоксильных групп составляет 0,02 — 10 мэкв/г, предпочтительно

0,4 — 4 мэкв/г.

Суспензионные полимеризаты — белые или слабоокрашенные гранулы (бусинки), которые в некоторых случаях могут быть сформованы нерегулярно и имеют диаметр 0,03—

1 мм, предпочтительно 0,05 — 0,05 мм, и насыпные объемы -1,4 — 8 мл/г, предпочтительно 1,4 — 5 мл/г. Содержание в них карбоксильIbIx групп составляет 0,02 — 10 мэкв/г, предпочтительно 0,4 —.4 мэкв/г.

Сополимеризаты могут набухать в воде до своего 1,1 — 2,5-кратного насыпного объема.

Они пригодны в качестве смол-носителей для фиксации веществ, которые могут реагировать с ангидридными группами сополимеризатов.

Смолы-носители при температурах между 0 и 30 С вносят непосредственно в водный раствор вещества, который нужно связать, предпочтительно в водный раствор протеина, причем значение рН должно поддерживаться постоянн ы м.

Если протсины должны быть связаны с сополимеризатами, то рН 3 — 10, предпочтительно от 5,5 до 9,0. Если в качестве протеина применяют пенициллинацилазу, то рН 5,7 и

6,8. Для поддержания рН добавляют основание (напрпмер, щелочи) и органические основания (например, третичные органические амины).

Весовое отношение связанного вещества, например, протеина или пептида, к смоле-носителю может изменяться в широких границах. Высокий выход получают при соотношении: 1 вес. ч. протеина к 4 — 10 вес. ч. полимерного носителя. Оптимальные соотношения зависят как от состава и структуры полимеров, так и от рода протеина.

В качестве стабилизаторов используют полиэтиленгликоли или неионные смачиватели для ослабления денатурирования на поверхностях, а также известные SH-реагенты или ионы металлов для специальных ферментов.

Необходимое реакционное время зависит o I рода полимера. Обычно реакция заканчивас1ся через 20 час при комнатной температуре.

При 4 С реакция протекает лучше, но медленнее. Полимер со связанным протеином затем отсасывают и отделяют на центрифуге и остаток промывают растворами солей высокой ионной силы, например 1М раствором .хлористого натрия, и затем буферным раствором, в котором фермент стабилен. При промывке растворами солей высокой концентрации от носителя отделяют ионогенно связанный протеин.

Смолы-носители связывают все вещества, которые имеют функциональные группы, способные реагировать с ангидридными группами полимеров. Этими веществами являются прежде всего концевые аминогруппы лизина и свободные аминогруппы концов пептидных цепей.

Пептиды и протеины, связанные с носителем, имеют большое хозяйственное и техническое значение. Дорогостоящие и нестабильные ферменты значительно стабилизируются путем связывания со смолой. Легкая и полная регенерация ферментной смолы позволяет многократно применять ферменты в течение длительного периода времени.

Расщепление пенициллинов с помощью связанной с носителем пенициллинацилазы осуществляют в промышленном масштабе. Связанный с носителем нерастворимый фермент суспендируют в растворе 75 000—

150000 IU/ìë пенициллина, например, пенициллина G или пенициллина V. Ферментное расщепление проводят при постоянном значении рН б — 9, оптимальное значение рН 7,8.

Для нейтрализации отщепленного ацильного остатка, например, фенилуксусной кислоты или феноксиуксусной кислоты применяют водные растворы щелочей, например, раствор едкого кали или раствор едкого натра, или органические амины, предпочтительно три4о этиламин. По расходу (потреблению) основания можно судить о скорости реакции и окончапии расщепления. Пенициллинацилаза катализирует как расщепление пенициллина до

6-АР$, так и синтез пенициллина вновь из продуктов расщепления. Равновесие зависит от значения рН среды.

При меньших значениях рН равновесие сдвигается в пользу исходного продукта пенициллина. Это можно использовать для переацилирования пенициллинов в присутствии других ацильных остатков или для синтеза цен ицилл и нов из 6-А PS.

Реакционная температура ферментного расширения составляет предпочтительно 38 С.

При более низких температурах активность фермента падает. Если расщепление осуществляют, например, при 25 С, то применяю вдвое больше фермента, чем при 380 С, прг одинаковом времени реакции.

Скорость реакции при указанной темпера туре зависит от специфической активности

; величества связанной с носителем пеницил . I Iíàäèëàçû. Кроме того, скорость реакцш зависит от отношения количества связанной < носителем пенициллинацилазы к концентра

537630 ции пенициллина. Исходная смесь для расщепления с концентрацией калиевой соли пенициллина G 100000 IU/ìã (1 мг калиевой соли пенициллина G соответствует 1598 IU (международные единицы) спустя 10 час при рН 7,8 и 38 С полностью гидролпзуется до 6-APS и фенилуксусной кислоты, если на единицу пенициллинацилазы применяются

3. 10 едпниц пенициллина G (ферментная единица U — определяется как активность, которая гидролизует 1 цмоль 6-нитро-3-(фенилацетил) -аминобензойной кислоты (НФАК) в минуту при 25 С). Доля сухой ферментной смолы составляет только 0,5 — 1 реакцион.ной смеси. Если на 10" IU пенициллина G применяют 2 единицы пенициллинацилазы, то полное расщепление длится только два часа. Возможны и более короткие промежутки времени реакции, если применяют еще более связанные пенициллинацилазы (при применении, например, связанной с носителем пенициллинацилазы из кристаллического фермента).

Связанная с носителем пенициллииацилаза может быть гранулообразной и отличаться высокой механической стабильностью н сравнительно высоким удельным весом. Этисвойства при многократном введении делают возМо?KHbIM применение е" в течение длительных периодов времени. Приготовленная связанная с носителем пенициллпнацилаза позволяет осуществлять быстрое и однократное фильтрование, так как благодаря механической стабильности не возникают никакие микрочастицы, засоряющие поверхность фильтра. Преимущества дает смола в Batch-процессе из-за сравнительно высокого удельного веса, который обусловливает быстрое отстаивание смолы, так что по окончании процесса находящийся над ней раствор мо?кно легко сливать.

Свойства полнмеризата делают возможным применение связанной с носителем пенициллинацилазы не только в Batch-процессах, но и в непрерывных способах, например, в реакционных колоннах, бисерная форма даетвысокую скопость протекания процесса.

Пример 1. 80 г тетраэтиленгликольдиметакрилата, 20 г ангидрпда малеиновой кислоты и 1 г нитрила азоизомасляной кислоты растворяют в 1 л бензола и нагревают при перемешивании в течение 4 час при 60 С. Затем добавляют 1 г нитрила азоизомасляной кислоты и 200 мл бензина (т. кип. 100 — 140 С) и полимеризуют 5 час при 70 С. Порошкообразный полимер отсасывают, суспендируют (взмучивают) один раз в бензоле и тпи раза в петролейном эфире (т. кип. 30 — 50 С) и высушивают в вакууме.

Выход 94 r. Насыпной объем 3 5 мл/г, объем набуханпя в воде 4,7 мл/г, удельная поверхность 5 м /г.

Содержание кислоты после омыления ангидпидных групп 3,5 мэкв/г.

П р и м ср 2. 1 г при отовленной сог. ясно примеру 1 смолы-носителя суспендируют г.

30 мл водного раствора пенициллинацилазы с удельной активностью 132 IU/ìã протеина

Биурет. При постоянном рН 6,3 путем добавления 1н. раствора едкого патра с установленным рН-значением суспензию перемешивают 20 час при 25 С. Затем отсасывают через стеклянную фритту (фильтр) 6 3 и промывают смолу 50 мл 0,05 М фосфатного буфера с рН 7,5, который содержит 1М хлористого натрия, и тем же буфером без хлористого натрия. Путем дальнейшего промывания активность смолы не изменяется.

Ферментные (энзиматические) активности (НФАК-тест), U (1 единица U соответствует превращению 1 ммоль субстрата в минуту):

Исходный раствор 132

Раствор, находящийся пад осадком, + промывная вода 12

Смола-цосптель после превра20 щения, 86, что соответствует 65% исходной активности.

Фермептную активность пенициллинацилазы измеряют колориметрически и путем титрования при помощи 0,002 M 6-нитро-3-(Nфенилацетил) - аминобензойной кислоты (НФАК) в качестве субстрата при рН 7,5 и

25 С. Молярный коэффициент экстинкции Е образующейся 6-питро-3-аминобензойной кислоты составляет 9090 при Х 405 нм.

П р lt м е р 3. Раствор 90 г этиленгликольдимстакрилата, 10 r ангидрида малеиновой кислоты и 1 г нитрила азоизомасляной кислоты в 1 л бензола полиме!?изуют при перемешпвании сначала при 60 С. Спустя 4 час добавляют 200 мл бензина (т. кип. 100—

140 С) и 1 r нитрила азонзомасляной кислоты и полимепизуют далее 2 час при 70 С и 2 час прп 80 С. Затем полимер отсасывают, промывают петролейным эфиром (т, кип. 30 —.

50 Г) и высушивают в вакууме.

Выход 97 г. Насыпной объем 6,4 мл/г, объ" ем при набухании в воде 8,0 мл/г, удельна поверхность 298 м /г.

Содержание кислоты после омыления а1

45 гидпидных групп 1,5 мэкв/г.

Пример 4. 6 г полученной согласно при меру 3 смолы-носителя вводят во взаимодей ствие, аналогично примеру 1, с 590 U пени циллинацилазы в 165 мл годы.

Ферментные активности (НФАК-тест), U:

Исходный раствор 590

Раствор, находящийся под осадком, + промывная вода 26

Смола-носитель после превращения 352, что соответствует 60О/о исходной активности.

Пример 5. Сополимерпзация 90 r диэтиленгликольдиметакрилата с !О г ангидрида малеиновой кислоты при условиях примера 3 дает выход 96 г, насыпной объем 5,5 мл/г, 60 объем прп набухании в воде 6,7 мл/г, удельную но с!?хность 9,2 м /г.

Годс !?я1апш кислоты после омылспия ангидпидных групп 1,9 мэкв/г.

П р и м с р 6. 1 г приготовленной согласно

05 примеру 3 смолы-носителя добавляют к рас537630

10

50

60 твору 50 мг неспецифической эластазы с ферментной активностью 139 U в 32 мл воды.

Композицию перемешивают 16 час при комнатной температуре, рН поддерживают постоянным 5,8. После превращения смолу отсасывают и промывают 50 мл 1н. раствора хлористого натрия в 0,05 М фосфатном буфере с рН 7,5 и затем 50 мл 0,05 M фосфатного буфера с рН 7,5.

Ферментная активность, Е (одна единица Е соответствует расходу 1 ммоль раствора едкого кали в минуту):

Исходный раствор 139

Раствор, находящийся над осадком,+промывные растворы

Эластаза, связанная со смолойносителем 15, что соответствует 11 исходной активности.

Ферментную активность определяют титрованием при помощи казеина в качестве субстрата (концентрация 11,9 мг/л) при рН 8,0 и 25 С.

Пример 7. 1 г приготовленной согласно примеру 5 смолы-носителя добавляют к раствору 50 мг кристаллической уреазы (Merck) в 32 мл воды. Композицию перемешивают при комнатной температуре 16 час при постоянном рН 6,3. Переработку осуществляют как указано в примере 3.

Ферментная активность уреазы, U (одна единица U соответствует количеству фермента, которое расщепляет 1 ммоль мочевины в минуту):

Исходный раствор 5013

Раствор, находящийся над осадком, + промывные растворы 1397

Смола-носитель после преврашения 1405, что соответствует 28% исходной активности.

Ферментную активность уреазы определяют титрованием с помощью 0,17 М раствора мочевины в качестве субстрата при 25 C и рН 6,1.

П р tt м е р 8. 0,4 r полученной согласно примеру. 5 смолы-носителя добавляют к 40 мг глютатиона в 32 мл воды 16 час при постоянном значении рН 6,3 и комнатной температуре. Смолу отсасывают, промывают 1н. раствором хлористого натрия в 0,05 М фосфатном буфере с рН 7,5 и затем водой, высушивают в вакууме при 100 С над пятиокисью фосфора и получают 0,47 г сухой смолы. Определение азота по Дюма дает значение 1,1%, которое соответствует содержанию 8,04% или

37,8 мг глютатиона. Это соответствует 94% введенного количества глютатпона.

Пример 9. 80 г тетраэтиленгликольдиметакрилата, 20 r ангидрида малеиновой кислоты и I г порофора V растворяют в 1 л бензола и при медленном перемешивании полимеризуют 16 час при 80 С.

Полимер обрабатывают аналогично примеру 1.

Выход 95 г, насыпной объем 2,5 мл/г, объем набухания 3,0 мл/г.

Содержание кислоты после омыления ангидридных групп 2,6 мэкв/г.

Пример 10. Взаимодействие 1 r приготовленной согласно примеру 9 смолы-носителя с пенпциллинацилазой аналогично примеру 2 дает следующие результаты:

Ферментные активности (НФАК-тест), U:

Исходный раствор 123

Раствор, находящийся над осадком,+промывные растворы 13

Смола-носитель после превращения 79, что соответствует 64% исходной активности.

Пример 11. В аппарате с мешалкой нагревают 1 л бензина (т. кип. 100 — 140 С) и 1 r нитрила азоизомасляной кислоты в течение

1 час при 90 С. Затем при 80 С прпкапывают раствор 95 г этиленгликольдиметакрилата, 5 г ангидрида малеиновой кислоты и 1 r нитрила азоизомасляной кислоты в течение 3 час и перемешивают 2 час при той же температуре.

Полимер отсасывают несколько раз, промывают бензолом и петролейным эфиром (т. кип. 30 — 50 С) н высушивают в вакууме.

Выход 96 г, насыпной объем 14 мл/г, объем при набухании в воде 18,2 мл/г, удельная поверхность 70 м /г.

Содержание кислоты после омыленпя ангидр идн ых групп 0,5 мэ к в/г.

Пример 12. 0,4 г приготовленной согласно примеру 11 смолы перемешивают с 40 мг глютатиона в 32 мл воды 16 час при постоянном рН 6,3 и комнатной температуре. Смолу отсасывают, промывают и высушивают согласно примеру 8. Получают 0,46 г смолы, которая содержит 0,9% азота по Дюма. Этому соответствует содержание 6,6% или 30,4 мг глютатиона, которое равно 70% от введенного количества.

Пример 13. Раствор 62,5 r тетраэтпленгликольдиметакрилата, 37,5 r ангидрида малеиновой кислоты и 1 г нптрпла азоизомасляной кислоты в 150 мл бутилацетата и 1 л бензина (т. кип. 100 — 140 C) полимеризуют при перемешивании 2 час при 70 С, 2 час при

75 С и 1,5 час при 90 С.

Полимер отсасывают, экстрагируют бензолом 24 час в экстракторе Сокслета и высушивают в вакууме.

Выход 77 г, насыпной объем 7,3 мл/г, объем при набухании в воде 8,2 мл/г, удельная поверхность 19,4 м /г.

Содержание кислоты после омыления ангпдридных групп 4 мэкв/г.

Пример 14. Раствор 90 г тетраэтилепглпKO. tьдiiibtCT3t(piIJI3Tа, 10 г 3iirilgpll+3 M3atPtti(0BoH кислоты и 1,0 г нптрила азоизомасляной кислоты в 200 мл ацетонитрила суспенднрую в 100 мл бензина (т. кип. 100 — 140 С), в ко тором растворяют 5 г смеси глицерин-моно- 1 дполеата. Реакционную смесь полимеризую вплоть до образования твердых частиц (гра нул) -2 час при 60 С, а затем 20 час пр

65 С. Полимеризат отфильтровывают, три ра

537630

Составитель С. Малютина

Техред М. Семенов

Корректор Л. Брахнина

Редактор Н. Хубларова

Заказ 2689/18 Изд. 1Г 1823 Тираж 576 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, %-35, Раушская наб., д. 4/б

Типография, пр. Сапунова, 2 за взмучивают в бензоле и три раза в петролейном эфире (т. кип. 30 — 50 С) и высушивают в вакууме.

Выход 94 r, средний диаметр частиц

0,35 мм, насыпной объем 2,8 мл/г, объем при набухании в воде 3,1 мл/г, удельная поверхность 3,4 м2/г.

Содержание кислоты после омыления ангидридных групп 1,5 мэкв/г.

Пример 15. 79 r влажной, связанной с носителем пенициллинацелазы с активностью

687 U, которую получают путем связывания пенициллина цилазы с сопол имер изатом из этиленгликольдиметакрилата и ангидрида малеиновой кислоты, согласно примеру 3, перемешивают со 129 г калиевой соли пенициллина G (чистота 98%) в 2000 мл воды 9 час при

38 С, рН поддерживают постоянным 7,8 путем непрерывной добавки триэтиламина. Поглощение триэтиламина прекращают с окончанием реакции. Связанную с носителем пеппциллинацилазу отделяют путем центрифугпрования или отсасывают, промывают последовательно 200 мл воды и 0,2 M фосфатным буфером с рН 6,5. Фильтрат, включая промывные растворы, сгущают в вакууме до

300 мл G-APS, осаждают йутем добавки полуконцентрированной соляной кислоты с изоэлсктрической точкой при рН 4,3 в присутствии 200 мл метилизобутилкетона. Спустя час отсасывают, промывают 200 мл воды и потом

200 мл ацетона. 6-APS высушивают в вакуу12 ме при 40 С, точка плавления 208 С. Выход в расчете на 6-APS составляет 67,8 r, что соответствует 90,5 / . Чистота 98 / .

Пример 16. 60 г влажной связанной с носителем пенициллинацилазы с активностью

673 U (НФАК-тест), которую получают путем связывания пенициллинацилазы с сополимеризатом из тетраэтиленгликольдиметакрилата и ангидрида малеиновой кислоты согласно примеру 1, перемешивают с 129 r калиевой соли пенициллина G в 2000 мл воды 9 час при

38 С. Значение рН поддерживают 7,8 путем добавки триэтиламина. Дальнейшую обработку осуществляют аналогично примеру 15.

16 Выход 6-ЛР5 составляет 65,3 г, что соответствует 87%.

Формула изобретения

Способ получения водонерастворимого препарата фермента с полимерным носителем, отл и чающий с я тем, что, с целью получения стабильного препарата пенициллинацилазы, фермент подвергают контакту с сополпмером и, р-моноолефиноненасыщенного ангидрида дикарбоновой кислоты с 4 — 9 атомамп углерода и ди- и/или полиметакрилата дни/или полиолов прп рН 5,7 — 6,8 и температуре 0 — 30 С.

Источники информа (ии, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент Франции Юв 2019083, кл. С 12D

13 00, 1970 (прототпп).