Способ выделения и очистки кислой протеиназы из растворов

Способ выделения и очистки кислой протеиназы из растворов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социал стическчх

Республик (11 53803.8

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТИЛЬСТВУ (61) Дополнительное и авт. свид-ву (22) Заявлено11.03.75 (21) 2113337/13 с присоединением заявки ¹ (51) М. Кл.2

С 12 Э 13/10 (23) Приоритет

Гооудаостоенный каин-.ет

Совета Мнниотров СССР го делом нзооротеннй н открытий (43) О тублд. овано05.12.76.Бюллетень № 45

45:: .":,ага опуоликования описания28.02.77 (53) УДК 577.15. ,07 (088. 8) (2) Автгры изобретения

Л.И. Орешенко, К.A. Калунянп, С.С. Фокина и Н.С. Шамис (71) Заявитель Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт (54) СПОС Б ВЬ!ДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ КИСЛОЙ ПРОТЕИНАЗЬ!

ИЗ PACTOGPOB

-сн.— сн-(н -сн-сн-сн P I 2 2!

ОН 0 О

Сн С2Е К(С2Щ Н- 1

Изобретение относится к ферментной отрасли мик робиологической промышленности; а именно к способам выделения и очистки кислой гротсиназы из растворов.

Известен способ выделения и очистки кислой протеиназы из растворов, например кулътуральной жидкости гриба AspergiII(us

awamo i, предусматривающий сорбцию фермента на ионообменнсм ссрбенте с последующей десорбцией его элюентом г 1 )

При работе — î из :естному сгособу имеют место большие потери фермента на стадиях очистки (до 90О/о). Полу"аемый фермент обладает недостаточной активностью, причем из-за больших потерь фермента на стадиях очистки работа связана с увеличением объема исходного материала и большого расхо5к да органического растворителя, что повышает себестоимость фермента.

Для ликвидации этих недостатков согласно предлагаемому способу B качестве сорбен-!

О ra используют анионообменный (отечественный) гель — сорбент в Сс форме, синтезирс ванный на основе поливинилового спирта, им ющий формулу а — 6нI

О ! ,Н

1 ! г 1 и -ОИ !

Ы <Н !

О ОН 4

1 I — i,Н вЂ” H-1И2- H— - OH — H—

538018

3 и обладающий сорбционной емкостью 0,50,8 мг.экв/г, набухаемостью не менее 2025 мг/г, при этом процесс сорбции осуществляют при рН 4,0 — 5,0, а процесс десорбции проводят 10%-ным раствором поваренной соли при рН 7,0-8,0.

Для перевода анионообменной смолы (АГСlп) в Сl -форму ее подвергают набуханию в воде, затем отфильтровывают и обрабатывают 30-60 мин 5%-ным раствором соляной р кислоты в количестве 3-5 об, на 1 об. набухшей смолы, После фильтрации смолу отмывают дистиллированной водой до рН 6,07,0, Расход воды при этом составляет 1015 об. на 1 об, смолы. 15

Использование смолы АГС-lп в С1-"форме с ионообменной емкостью 0,5-0,8 мг. экв/г и набухаемостью 20-25 мл/г обеспечивает 90-94% сорбции кислой протеиназы и 86-90% десорбции фермента, Элюент берут в количестве 8-10% к объему обрабатываемой исходной культуральной жидкости.

В результате такой обработки достигается десятикратное концентрирование кислой протеиназы и в 5 раз повышается степень очистки фермента. Из элюента фермент выделяют одним из известных способов, например осаждением органическими растворителями. 30

Препарат кислой протеиназы, полученный по предлагаемому способу, имеет активность, определенную стандартным методом (модифицированный метод Ансона с казеинатом натрия) ПА 200-250 ед/г по активности он в 1000-1500 раз выше, чем активность

его в исходной культуральной жидкости.

Пример 1. Концентрирование и очистку кислой протеиназы проводили из фильтрата культуральной жидкости Amp а(иО- 40

mori 78-2. Процесс сорбции вели в динамических условиях в колонке высотой 30 см и диаметром 3, 5 см. Анионообменный гельсорбент АГС-lп в количестве 5 г замачивали и отмывали дистиллированной водой, 45 после чего ионообменник переносили в колонку, Подготовленный таким образом ионообменник занимал 2/3 объема колонки. Обработку проводили 51 -ным раствором НС1, для чего через колонку пропускали 600 — 50

700 мл этого раствора с последующей отмывкой 1,5 — 2,0 л дистиллированной воды. Затем через колонку пропускали фильтрат культуральной жидкости с активностью 0,15 ед/мл и рН 4,6. Процесс сорбции вели со скорос- б тью 500 мл/час до появления в фильтрате фермента 5-10% протеолитической активности от исходной (в расчете на 1 мл). Через колонку было пропущено 830 мл фильтрата культуральной жидкости. бО

Сорбционная емкость смолы АГС-lп по кислой протеиназе составила 25 ед/г смолы.

В этих условиях на смоле было сорбировано

94% фермента от содержавшегося в фильтрате культуральной жидкости.

Десорбцию фермента проводили 10%-ным раствором NaC1 с рН 7,5. Расход элюента составил 85 мл, скорость его 150120 мл/час. Десорбция прощла на 90%, удельная активность фермента в элюате в 5 раз выше, чем активность в фильтрате культуральной жидкости. Из полученного элюата после предварительной корректировки рН до

4,5 — 5,0 фермент осаждали этанолом в соотношении элюата и этанола 1:4. Осадок отделяли на центрифуге и высушивали лиофильно.

Пример 2. Концентрирование и очистку кислой протеиназы проводили из фильтрата культуральной жидкости гриба АСр цматпог

1 6. Процесс сорбции вели в динамических условиях в колонке высотой 150 см и диаметром 16 см. В колонку загружали

250 r (анионообменного гель-сорбента АГСlп) по сухому весу после предварительной его обработки и перевода в Cl -форму. Через колонку со скоростью 10 л/час пропускали 80 л фильтрата культуральной жидкости Amp.awamori 16 с активностью кислой протеиназы 0,2 ед/мл и рН 4,15. Сорбция фермента в этих условиях прошла на 94%.

Десорбцию кислой лротеиназы проводили

10/-ным раствором КаСВ при рН 7,0.

Элюат в количестве 8 л пропускали через колонку со скоростью 1,2-1,5 л/час. Десорбция фермента прошла на 86%. Активность фермента в элюате в 8,5 раз выше чем

/ активность фильтрата культуральной жидкости. Удельная активность фермента была повышена в 5-7 раз. Фермент из элюата с рН 4,5 осаждали этанолом, осадок отделяли центрифугированием и высушивали лиофильно, Высокоочищенный препарат кислой протеиназы Протаваморрин Г25Х, полученный по предлагаемому способу, имел активность до 230 ед/г. Содержание белка в препарате 45-50%.

Таким образом, применение смолыАГС-lп по предлагаемому способу позволяет одновременно концентрировать и очищать кислую протеиназу непосредственно из фильтрата культуральной жидкости. Достигнутая десятикратная степень концентрирования фермента в 10 раз сокращает расход органических растворителей, применяемых для выделения фермента, и значительно сокращает емкостное оборудование, используемое для его производства. При этом в 5 раз повышается степень чистоты получаемого препарата.

538018

Формула изобретения ей — Сй - CH- QH - СН-СН - СН

) I

ОИ О О ! 1 си с1и %(с н5) ес1

Составитель М. Андреева

Техред О. Луговая Корректор B. Зорина

Редактор Л. Ушакова

Заказ 5670/3 5 Тираж 555 Подписное

БНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ выделения и очистки кислой протеиназы из растворов, например культуральной жидкости гриба А5регц Жив аик 0га,предусматриваюший сорбцию фермента на ионообменном сорбенте с последующей десорбци" обладаюший сорбционной емкостью 0 5

И

08 ,8 мг.экв/г и набухаемостью не менее2025 м

5 мл/г, при этом процесс сорбции осушествляют при рН 4-5, а процесс десорбции— при рН 7-8. его элюентом, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и активности фермента, снижения его себестоимости, в качестве сорбента используют анионообменный гель-сорбент в Cl -форме, синтезированный на основе поливинилового спирта, имеющий формулу

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Авторское свидетельство М 249329, кл.С12 3 13/10, 1969 г.