Способ количественного определения -метионина
Патент 538021
Авторы
Способ количественного определения -метионина
Иллюстрации
Реферат
ко-тех ифт
Союз Советских
Социалистических
023.
0 Il -и-Й-Ф
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
Республик
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
;61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 28.03.75 (21) 2135257/13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Г1рцоритет (43) Опубликовано05.12.76.Бюллетень №45, (4о) Дата опубликования описания28.02.77 (51) М Кт с
С 12 К 1/00
С 12 D 13/06
Государственный комитет
Совета Министров СССР по делам иэооретений и открытий (53) УДК 66 3. 1 32:
: 576.8.097 (088,8) (72) Авторы изобретения
М.Г. Оганесян и С.В. Кажоян
Чаренцаванский филиал Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (71) ЗаявИтель (54) спОсОБ кОличестВеннОГО ОпРеделения L -метиОнинА! изобретение относится к микробиологиЧеской промышленности, а именно к области количественного определения аминокисJIoT, в частности для ксличественного определения L -метионина в питательных средахх.
Известны различные способы микробиологического количественного определения аминокислот (11, Однако все эти способы коли ественного )p анализа аминокислот характеризуются тем, что определение ведется с помощью ауксот= рофных мутантов микроорганизмов в жидких средах. По этим способам микробиологическое определение аминокислот позволяет вес- 15 ти анализ только в синтетических и водных средах.
Наиболее близким к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является микробиологичес-20 кий способ количественного определения метионина с использованием штамма Bact.col EZ3
Известный способ определения метионина позволяет вести анализ только в водных и 25 солевых растворах, но не пригоден для определения метионина в сложных органических смесях, например культуральных жидкостях, полученных после ферментации аминокислот. содержащих, помимо самих аминокислот, так— же азотистые основания, витамины и др.
Таким образом, этот способ не годится для определения L -метионпна, во — первых, в культуральных жидкостях после ферментации: во-вторых, в мутных жидкостях и, втретьих, в присутствии других аминокислот и в первую очередь валина, ингибирующего рост E.coB .
Uerrb изобретения — более точное определение 1 -метионина в средах, содержащих валин.
Достигается это тем, что по предлагаемому способу в качестве индикаторных мик— роорганизмов используют штамм Escape!-ichia
СОГ,1 М- 30-1.
Технология способа состоит в следующем, Сначала проводят подготовку проб для определения, Для этого пробы культуральных жидкостей после ферментации отделяют центрифуги— д
538021 рованием (30 мин 4000 об/мин) от микроорганизмов — продуцентов аминокислот, На- к досадок разводят в минимальной среде в со- т отношении 1:5, инкубируют в кипящей водя- ц ной бане в течение 20 мин, затем проводят повторное центрифугирование (20 мин, 4000
Go/ìèí) . ним значениям мутности строят стандартную ривую, характеризуюшую ответную реакцию ест — культуры в зависимости от концентраии чистого метионина в среде.
Характеристика индикаторного штамма.
Индикаторный штамм Е со ауксотрофный по метионину, получен как производное
E. eofi К 1 2 (5 ) (прототроф) под действием химического мутагена 1-метил-3-нитро-1-нитрозогуанидина. Было получено большое количество метиониннедостаточных мутантов
Е. cali мет ), которые сохраняют все свойства, присущие исходному штамму
Е cori. К 12 (S )), за исключением ауксотрофности по метионину.
Среди большого числа Е. eofi мет мутантов был отобран штамм, который лучше других отвечал требованиям, предъявляемым к тест-культуре: очень чувствителен к метионину (наблюдается рост культуры в присутствии метионина в концентрации 1 мгк,мл среды) и имеет низкую частоту oåâåð— 9 сии 2,2 ° 10
Однако как и все штаммы Е.соК, так и полученный мутант ингибируется валином, из-за чего он не пригоден для определения метионина в присутствии валина. Поэтому у штамма Е. СОК, ауксотрофного по метионину, был получен валин-резистентный мутант, рост которого не подавляется B среде с валином, вследствие чего такой штамм пригоден цля определения метионина в культуральных жидкостях, содержащих валин.
Способ количественного определения L
-MeTpGHHHB в питательных средах путем внесения в них индикаторных микроорганизмов, отличающийся тем, что, с целью более точного определения -метионина в средах, содержащих валин, в качестве индикаторных микроорганизмов используют штамм Еьсhevich a со11 М-30-1.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:
1. Рубан Б.Л. и Вербина H.Ì. "Биосинтез аминокислот микроорганизмами", М., "Наука", 1 968.
2.Авт.св. № 1 34394, кл. С 12 К .1/00, 1959 (прототип).
Полученный таким образом надосадок в зависимости от ожидаемой концентрации ами-10 нокислоты в пробах. разводят в 25, 125, 625 и т.д. раз в минимальной среде М 9 следующего состава;
NH С6 — 1 г, Na HP0 — 6r, КН РΠ— 3 г, NaC3 — 5 г, вода—
1000 мл.
Во все разведения добавляют определенное количество суспензии индикаторного штамма. Инкубируют в течение 24 час при
37оС.
Определение мутности растворов проводят фотометрированием при помощи фотоэлек25 трокалориметра (кюветы — 5,060, светофильтр № 6) с последующим определением концентрации метионина по стандартной кривой.
Подготовка индикаторной культуры.
Ауксотрофную по метионину культуру
Е,соЕ инкубируют при 37оС стационарно в течение 18 час и переносят в минимальную среду М 9,содержащую добавки L -метионина (20 мкг/мл, где и выращивают до титра
1,0 — 5,0 10 . В каждую пробирку с раз9 ведениями исследуемой жидкости добавляют определенное количество этой суспензии из расчета, чтобы конечный титр культуры получился 0,5. 10 .
Построение стандартной кривой.
В пробирки с разведениями в минимальной среде ферментационной среды, на которой проводилась ферментация микроорганизмов-продуцентов, добавляют различные концентрации метионина (100,50, 25, 20, 10,5, 2,1 мкг/мл). Во все разведения добавляют определенное количество суспензии индикаторной культуры. Инкубируют в течение 24 50 час при 37 С. Определение мутности расто воров проводят фотометрически на ФЭК (кюветы — 5,060, светофильтр № 6). По средФормула изобретения
КНИИПИ
Заказ 5670/15 Тираж 555 Подписное
Филиал ППП Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4