Способ получения протеиносодержашего вещества
Патент 540578
Авторы
Классы МПК
Способ получения протеиносодержашего вещества
Иллюстрации
Реферат
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
Союз Советских
Социалистических
Республик (11) 540578
К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту(22) Заявлено 13.05.71 (21) 1659677/13 (23) Приоритет — (32) 14.05.70 (31) 23452/70 (33) Великобритания (43) Опубликовано 25.12 76. Бюллетень №47 (45) Дата опубликования описания 230877 (51) М. Кл. а
С 12 0 13/06
Гасударственный комитет
Совета Министров СССР оо делам изооретений н открытий (53) УДК
663.18 (088 8) Иностранцы
Джеральд Лионель Соломонз и Джеральд Уильям Скзммель (Великобритания) (72) Авторы изобретения
Иностранная фирма
"Рэнк Ховис Мак-Доугалл Лимитед" (Великобритания) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНСОДЕРЖАЩЕГО
ВЕЩЕСТВА
Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения протеннсодержащих веществ, например грибных протеинов действием микроорганизмов.
Известен способ получения протеинсодержащего вещества путем выращивания грибов рода
Fusarium в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей источник углерода в виде углевода, источник азота, минеральные соли и стимуляторы роста, с последующим выделением полу- 1п ченного продукта из культуральной жидкости.
Цель изобретения — получение продукта высокого качества.
Для этого при предлагаемом способе получение протеинсодержащего вещества из рода Еоваг пгп ис- Q пользуют вид yraminearum.
)пэ amga raminearum используют штамм Schwabe, депонированнйй в Микологическом институте Британского содружества наций за N 1М1
45425. 20
Кроме того, из вида graminearum используюi штаммы за Р 1М1 154209, 1М1 154211, 1М1
154212, 1М1 154213, 1М1 154210.
При этом выращивание проводят Ври рН преимущественно равном 3,5 — 7. Ф
В качестве стимуляторов роста используют бнотин и холин.
Способ осуществляют при коэффициенте раз-1 бавления среды, предпочтительно равном 0,1 час .
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом, Протеинсодержащее вещество получают путем выращивания микроорганизмов, например грибка рода Fusarium, в водной питательной, среде, содер. жащей основные стимулирующие рост питательные вещества, углерод которых в виде способного ассимилироваться углевода служит лимитирующим субстратом при пролиферации, и выделения полиферированного организма.
На стадии инкубации используют субстрат растительного происхождения, например крахмал, крахмалсодержащие вещества или продукты их гидролиза, вещества содержащие сахарозу или продукты ее гидролиза, например, инверсированный сахар, или их смеси.
Субстрат может содержать гидролизованньтй крахмал картофеля, мелассы бобовых или тапнока, глюкозу. Возможно также использование субстрата животного происхождения
«Б пода Fusar ium используют вид gr aminearum.
540578
Из вида gram inearum используют штамм Schwabe, депонированный в Микологическом институте британского содружества за N 1М1 145425, его варианты и мутанты.
Кроме того, из вида graminearuro использУют штаммы за Р 1М1 154209, 1М1 154211, 1161
154212, 1М1 154213, 1М1 154210.
Штамм Fusar ium+raminearurn 1lha6e 1М1 145425 непатогенен относительно пшеницы и обладает следующими морфологическими свойствами. )9
Среда. Картофельный агар с сахарозой Чапек— Докс (модифицированный агар-оксоицц). 250 г картофеля промывают, нарезают мелкими кусками, помещают в пресс-варильник на 15 мин под давжны 10,3411- 16 н/м . Отвар фильтруют че- ))) рез два слоя муслина. В мутный фильтрат добавляют 2% глюкозы и 2% агара, после чего среду автоклавируют и диспергируют.
Условия роста. Несколько недель при 25 С.
Скорость роста 4,0 см за 3 дня, 3,0 см — за 3 дня. 20
Характер роста. Хлопьевидные, распространенные колонии с белым воздушным мицелием. Суб страт на картофельном агаре с сахароэой — серовато-розовый с кусочками от малинового до желтого. Тенденция к соломенно-желтому цве- М ту на агаре Чапека-Докса. Иногда образуется темно-красный пигмент (в особенности при старении).
После одной-двух недель воздушный мицелий склонен к окрашиванию в бурый (коричневый) цвет и сплющиванию. Колонии становятся слизис- Э) тыми при образовании спородохий и цветом от розового до коричневого на КСА (картофельном агаре с сахарозой) и оранжево-розовыми на ЧДА (агаре Чапек;Докса) .
Эксудат не образуется, а образование пигмента 85 соответствует окрашиванию мицелия.
Конидии. Микроорганизмы не образуют микроконидий. Микроконидии образуются иэ отдельных боковых стеригм или разветвленных конидиофор с короткими стеригмами. В старых культурах кони- 40 диофоры агрегируются с образованием спородохия (в особенности на ЧДА). Конидиц различны: от серповидных до изогнутых дорзо-вентральных перегородок от 3 до 5, в более молодых культурах обычно до 5. 45
Размеры спор колеблются от 25-50 х 2,5 до
4,0 мкм.
Опорная клетка часто снабжена ножкой (в особенности у длинных с 5 перегородками спор1.В мицелии присутствуют разбухшие клетки и иногда 50 включены хламидоспоры, отдельные или цепочки.
Далее приводится пример получения вариантов (или изолятов) штамма Fusarium graminearum
Швабе 1М1 145425 и их морфологические особенности. М
Иэоляты, полученные на.непрерывной культуре Fusarium graminearum Швабе 1М1 154 — 209 до
1М1 154213 отбирают с пластинок солодового агара, инокулированных бульоном из ферментера, в котором выращивают Fusarium graminearum Швабе. 69
154245 на глюкозе (солевой среде при 30 С прн непрерывных культуральных условиях с лимитированием углерода при скорости разбавления0,1 — 0,15 час,.
Из ферментера отбирают пробы с интервалами, примерно, в 100час для определения вариантов.
Изолять: 1М1 154209 — 154213 отбирают с пластин, приготовленных с 1100 час образца, Эти изоляты представляют главные виды морфологического варианта, полученного в процессе ферментации. В приведенных в примере условиях варианты появляются на пластинах послеъоо час. С этого времени они непрерывно образуются, и йопуляции медленно меняется в процентах каждого вида.
При этом используют в ферментере культуральную среду состава,%:
0,3
Раствор %.
Глюкоза 3,0
Сульфат аммония 0,25
Монокалийфосфат или КНгРОа
Против онспениватель-полипропиленгликоль 2000,стерилизованный при рН 3,0 в течение 30 мин цри 10,3411,10а н/мг О,"1
РасТаор 2.
Mn SO 4Нг О 0,0005
FeSOа НгО 0,0005
ZnSO4 7НгО 0,0005
CoCIг ° 6Нг 0 0,0001
CuSOа ° 5Нг О 0,0001
Na MoO, 2Н, О 0,0001.
Стерилизуют в течение 15 мин при 10,3411 н/м
Раствор 3.
Биотин 0,10 или 20 мкг/л
Холин О 1 или 2мг/л
Мети онин О или 600 мг/л.
Стерилиэуют раздельно путем фильтрации. Все растворы вносят асептически в резервуар, помещенньй в хемостат емкостью 8,5 л при следующих условиях роста.
Температура 30 С, аэрация 1 объем/м, перемешивание при 800 об/мин на турбинно-дисковой мешалке с 6 лопастями в ферментере с отбойником.
В ферментере поддерживают рН 5,0 путем автоматического добавления стерильного аммиака. Состав раствора 3 меняют через различные интервалы времени для определения максимума различными добавками, например, биотина или биотина с холином.
1.корость роста 0,1 — 0,15 час.
Пять иэолятов имеют следующие морфологические свойства.
Среда, Картофельный агар с сахарозой
Агар Чапек-Докс (оксоид) .
Промывают 250 r картофеля, измельчают, помещают в .пресс-варильник под давлением
10,3411 10а Ä/Mz на 15 мин.
Отвар пропускают через двойной слой муслина.
540578
В мутный фильтрат добавляют 2% глюкозы вместе с 2% arapa, после чего среду автоклавируют и диспергируют.
Условия роста: 25 С.
Характер роста, Fusar ium graminearum Schwabe
N 1М1 154209.
Колония морфологически аналогична исходной
A3/5 за исключением того, что диаметр колонии меньше и равен 1,5 см через 3 дня при 30 на ЧДА.
Хлопьевидный воздушный мицелий различен в колониях, но меньше чем у У 1М1 154211. Старые культуры обнаруживают побурение мицелия.
С обратной стороны желто-бурые до серо-розо-. вых секторов с некоторой пигментацией. Fusarium
graminearum Schwabe Р 1М1 154211.
Интенсивный белый с хлойьевидным опущением воздушный мицелий. Диаметр колоний меньше, чем у исходной АЗ/5,2 см через 3 дня при 30 на
ЧДА. С обратной стороны сегменты от оранжеворозового до серовато-розового.
Fusarium graminearum Schwabe N 1М1 154212.
Микроскопически похож aaFusarium grami,"
nearum 1М1 154211, но с обратной стороны. светлее (от оранжево-розового до прозрачного).
Fusarium graminearum Schwabe У 1М1 154213.
Небольшие колонии куполообразной формы.
Мицелий короткий, спутанный, со склонностью к образованию спиралей. Многие спородохийобразные структуры имеют розоватый вид у начала полосы. Розовая окраска на периферии. Диаметр колонии
6,4 см через 3 дня при 30 на ЧДА.
Fusar ium graminearum Schwabe М 1М1 154210.
Вид очень нестоек и непрерывно меняется до вида 1М1 154213. Похож на 1М1 154209, колонии имеют несколько больший диаметр (2,4 см через 3 дня и более). Вид 1М1 154210 более стоек„чем 1М1
154213.
Конндии.
Fusarium гапппеагцгп Schwabe N 1М1 154209.
Образуются обильные микроконидии аналогично исходному АЗ/5.
В старых культурах образуются спородохии.
Индивидуальные макроконидин похожи на исходный АЗ/5 по форме и размерам, 25-50.3,0-5,0 мкм, В старых культурах образуется много спородохий.
В мицелии этого вида обильны хламидоспоры, интеркамерно и терминально. Они шарообразны
10-12 мкм. Иногда отдельная клетка микро- . конидии образует хламидоспору.
Fusarium graminearum Schwabe 1М1 154211.
Меньше микроконидий, чем у 1М1 154209, меньше размером, проще, 1 перегородки, длиной
25-35 мкм. Образуется немного спородохий.
Обильные хламидоспоры, инеркалярно, отдельные и в цепочках.
Fusar ium graminearum Schwabe 1М1 154212.
Похож на 1М1 154211, но имеет больше макроконидий, по количеству столько же, сколько у вида
1М1.154209.
Fusarium draminearum Schwabe 1М1 154213.
Макроконидий мало, имеются типа спородохии .вплоть до пачек хламидоспор. Много хламидоспор в мицелии. Макроконидии меньшего размера, чем у исходного, 30-35 ° 4 мкм с 2 перегородками.
Fusarium grays(nearum Schwabe 1М1 154210.
Похож на вид 1М1 154209, с обильными макроконидиями и хламидоспорами. Типичные макроконидии, 35-45 i 4 мкм.
Температуру инкубации поддерживают в преде111 лах 25-34 С (предпочтительно 30 С), инокуляцию путем предварительной стадии проращивания 2-10% инокулята, обычно от 5-10%. рЯ субстратной среды в процессе инкубации поддерживают в интервале 3,5-6,7, способствующем 5. максимальному росту.
Период роста при серийном культивировании в указанных условиях составляет обычно 20- 48 час.
Как при периодическом, так и при непрерыв.ном культивировании следует проводить аэрирование и перемешивание, обеспечивающее достаточное содержание растворенного кислорода и преодоление его дефицита, лимитирующего рост.
В субстратной среде должно быть достаточное количество основных питательных источников аэо35 .та, серы, фосфора.
Для обеспечения максимальной скорости роста необходимо наличие витаминов, например биотина.
В субстратную среду добавляют нетоксичный противовспенйватель для регулирования пенообраЭО. зования в процессе ферментации.
Образующийся мицелий отделяют путем промывки, фильтрации и сушки. При снижении содер. жания влаги до 50% путем фильтрации под давлением последующую сушку не проводят в строгом
65 температурном режиме. Способ сушки не должен снижать питательную ценность мицелия, поэтому сушку ведут воздушной струей при 75 С или вымораживанием (сублимацией) .
Получаемый по предлагаемому способу грибко40 вый мицелий связывает воду и может использоваться в качестве сгустителя или желирующего средства.
Не будучи изолятом он сохраняет витамины и прочие питательные вещества, например липиды и
45 некоторые углеводы.
Грибковый мицелий имеет. удовлетворительные свойства выпекания и может быть использован в производстве обогащенного белком хлеба и закусок.
N Благодаря волокнистой структуре грибковый мицелий можно печь, жарить, готовить иэ него сдобу и другие пищевые продукты по виду и приемлемости сравнимые с обычными пищевыми продуктами.
М, При м е р 1. Готовят 10л культуральной среды и стернлизуют в ферментере при перемешивании состава
Мелассу (сахарный тростник) до ь% вес. объем сахара
60 Сульфат аммония 1Ä2%
540578
N@H,РО, 0,25%
Стерилизуют 30 мин при 10,3411 10 н/м, СаСОз 0,5 вес.%/объем
Стерилизуют 3 часа
Компоненты среды вносят асептически и охлаж- . денными до 30 С.
Инокулум, эквивалентный 5-10 об.% культу ральной среды, выращенный на среде глюкозы (замочной жидкости кукурузы) или на другом соотвествующем материале в колбе-качалке, ино- 10 кулируют суспензией спор организма, содержаний штамм Fusarium graminearum Schwabe 1М1 145425.
Выращивают 18-24 час при 30 С во вращающеися качалке и вносят асептически в ферментер.
Ферментер, инкубированный при 30 С; пере- 1я мешивание при 800 об/мин с помощью турбинег дисковой мешалки с 6 лопастями и отбойником, при аэрации через среду стерильного воздуха.
1 об/мин.
Через 35 час извлекают выросший мицелий, 0 центрифугируют, промывают водой и сушат на о ленточной сушилке горячим воздухом при 75 С.
Высушенный тав,%:
Общий азот
Зола
Ли лиды
NPUop продукт имеет следующий сос8
5,3
2,7
52 в пересчете на общий азот
Таблица 1.
Компоненты культуральной среды
Конечный % рн
3,0
3,0
0,7
1,0
0,001
0 0005
0,0001
0,0001
0,0001
00001 50
0 0015
0,1
Глюкоза
Сульфат аммония
КНг РОа
FeSO4 ° 7НгО
Мп804 4НгО CuSO ° 5НгО
Mg SO44 7Нг О
Na, MoO; 2Н, О
СоСгг 6Нг0
СаС(г 2Н, О
NaOH
5,0
3,5
Указанную культуральную среду стерилиэуют при нагревании 15 мин при 10,3411 104 н/м г, после чего в нее добавляют стерилизованные вита- М мины или аминокислоты.
Растворы вносят в ферментер асептически. Инокулум выращивают и вносят аналогично примеру 1, но конечную концентрацию в ферментере доводят до 0,5 г воэдушносухого мицелия на 1 л. 60
При мер 2. Готовят 10л культуральной среды и стерилизуют в ферментере емкостью 14л (НЫО- Бунсвик, Микроферм) .
Данные о составе культуральной среды приведены в табл l.
Условия выращивания: температура 30 С аэрация 1 об/мин, скорость мешалки регулируют для поддержания в.культуральной среде растворенного кислорода на 25% выше концентрации насыщения измеряемой прибором фирмы Нью-Брунсвик Инк, Стерильный противовспениватель — пропиленгликоль 2000 добавляют для подавления пенообразования, а рН поддерживают в интервале 6,0-6,3 добавлением стерильного раствора едкого калия.
При выращивании культуры микроорганизмов без добавления стерилизованных витаминов или аминокислот скорость их роста очень медленная, а при добавлении последних с конечной концентрацией биотина 50 мкм/ л в культуральной среде скорость роста равна 0,2 час . При добавлении в культуральную среду стерилизованных витаминов или аминокислот с конечной концентрацией биотина 50 мкг/ л, хлорида холина 30 мг/ л и метионина
-4.
300 мг/ л скорость роста равна 0,25 час .
Пример 3. Приготовляют 100 л культуральной среды и стерилизуют в ферментере емкостью
130 л из нержавеющей стали.
Компоненты
Глюкоза
Кукурузная замочная жидкость (50% твердого вещества)
Сульфат аммония
КН< РО4
M)SO4 7Нг О
ZnSO4 7Нг О
FeSO4 7Нг О
MnSO4 4НгО
Конечная концентрация, %
4,0
0,8
0,2
0,2 0,025
0,0005
0,0005
0,0001
Среду стерилизуют 30 мин при рН 3,0 и 10,3411 н/м, затем охлаждают до 30, рН регулируют до
5,0 стерильной добавкой аммиака.
Биотин стерилизуют фильтрацией, вносят асепти. чески, обеспечивая конечную концентрацию 40 мкг/л.
Ферментер инокулируют 10 л культуры, выращенной в резервуаре в течение 18 час при 30о на среде, содержащей, %: 2 глюкозы,0,4 триптона (оксоид), 0,1 дрожжевого экстракта (оксоид) 0,15 сульфата аммония, 1 монокалийфосфата, 0,1 едкого патра, 0,025 сернокислого магния, 0,001 сульфата двухвалентного железа, 0,001 сернокислого цинка, 0,0005 ной 45 мин при 10, 34110. 10 н/м, инокулированной суспензией спор штамма. Fusarium graminearum ц1вабе 1М1 145425. о
Условия выращивания: температура 30, аэрацию регулируют в соответствии с необходимой концентрацией растворенного кислорода на 10 % выше концентрации насьпцения в культуральной жидкости.
Для подавления пенообразования добавляют полипропиленгликоль 2000, поддерживая рН около
5,0 путем добавления стерильного аммиака. Образсульфата марганца, 0,001 сульфата меди, 0,05 противовспенивателя-пропиленгликоля 2000, стерилизован540578
znS04 7Н2 О
СоС1, 6Н О
СоБ04 5НгО
Маг Мо04 2Нг О
0,0005
О,ООО}
О,ООО1
О.ООО1 цы мицелия rrocne выращивания содержат в пересчете на сухой вес: общий азот — 8,0 — 8,6%; азот альфааминокислот — 6,4- 6,6%. Начальная скорость роста в комплексной среде, полученной из купьту-1 ральной среды и инокулума, равна примерно 0Ä3 час, Ниже приводятся примеры 5 и 6, выполнения предлагаемого способа при непрерывном культивировании
Пример 4, Готовят культуральную среду следующего состава; 16 тй1 хъ ъз}э 1 конечная концентрация,%;
Глюкоза 3,0
Сульфат аммония 0,25
Монокалийфосфат или КНг РО4 0,3 Ьь
Сульфат магния 0,025
Полипропиленгликоль2000 0,01 т".терилизуют при рН 3,0 30 мин при 10, 3411 н/м .
Раствор 2
0,0005
0,0005
MnSO4 4НгО
FeS04 ° 7Нг О
Таблица 2
Раствор 3
Раствор 3
0,17-0,19 0,5
6,3
78
600 0,2 — 0,21 0,5 7,.7 — 8,6 6,1 — 6,3 59
0,3 углеводов
1,33
0,25
0,15 б,б
7,1
5,9
4,0
5,0
7,8
8,6
67
71
54
57
Раствор 1. Глюкоза (стерилизация отдельно при рН 3,0 в течение
10 н 6 8941, 104 (г)
Раствор 2. Сульфат аммония
Мандкалийфосфат
9 7 г О
FhBO4 (H ) 2- О бг Нг О
60 Мп 804 4Нг О
3,0
0,565
1,0
0 025
0,0005
0,0005
Пример 5. Готовят культуральную среду ссъставл %:
Крахмал бобовых (обработан альфаамилазой)
Кукурузная замочная жидкосп
Сульфат аммония
Монокалийфосфат
Пример 6. Культуральная среда и условия те же, что в примере 5. рН выдерживают на уровне 5,0 в течение всего процесса при 26-34 С. Оптимальная температура
30-32 С.
Пример 7. Дупликатные колбы-качалки емкостью 1 л заполняют 200 мл среды следующего состава, конечная концентрация,%:
Стерилпзуют 15 мин.
Раствор 3.
Витамины и/или аминокислоты стерилизуют фильтрацией, как это описано ниже.
}}се растворы вносят асептически.
Условия выращивания в хемостате емкостью
8,5 л следующие.
Температура 30 С, аэрация 1 об/мин, перемешивание при 800 об/ мин с помощью шестилопастной турбинно — дисковой мешалки в ферментере с отбойником.
В качестве микроорганизма используют штамм
Fusarium qraminearum Schwabe 1М 145425, рН 5,0 поддерживается автоматически добавкой стерильного аммиака.
Данные об условиях выращивания микроорганизма приведены в табл. 2.
Сульфат магния 0,025
Полипролиленгликоль 2000 (объем/вес) 0,025
Стерилизчют 30 мин при 10,3411 10 н/м и рН 4,0.
Среду вносят в 8,5 л хемостат в условиях по примеру 4 при рН 3,5 — 6,0 и скорости роста 0,1 час .
Данные об условиях выращивания микроорганизма приведены в таблЗ, 54Q578
CuSO0. 5112 О
CoCI2 бН О
CaCI„" 2H„O
° е32 а / 004 «Н2 О
МаОН
Стерилизацию и течение 15 мин
Составитель А. Бражникова
ТехРед И ястало2п, Редактор А БеР
Заказ 6062/72
Корректор И. 3олотовская
Тираж 555 Подписное
ЦИИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР ло делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4
0,0001
Q QQ01
0,0015
Q,QQQQ01
0,2 проводят при 10,3411 10" н/м при конечном рИ 6,0.
Раствор 3, Витамины стерилизуют фильтрацией.
Растворы вносят асептически, обеспечивая конечный объем 200 мл, затем колбы инокулируют промьпыми спорами штамма Fusarium gram nåarum
Schwabe 1М1 154209 до концентрации 8 10 /мл.
Условия роста; -емлература 30, 140 об/мин на орбитальной качалке с дугой качания 508 мм.
Через час интервалы измеряют рост путем определения оптической плотности образца при .б00 ммк.
При выращивании микроорганизма штамма Fusariurngraminearum Schwabe 1М1 154209 на среде, не включающей раствора 3, скорость его роста очень медленная.
При включении раствора 3 в среду и конечной . концентрации биотина в ней 50 мкг/л скорость роста составляет 0,22 час .
М
При включении раствора 3 в среду и конечной концентрации биотина в ней 50 мкг/л и хлористого холина 50 мг/л скорость роста составляет 0,27 час.
При выращивании кроорганиэмов штаммов
Fusarium graminearum Schwabe 1М1 154211, 1М1
I154212, 1М1 154213, 1М1 154210 и 1М1 145425 на среде, описанной в примере 7, беэ включения раствора 3 стерилизованных фильтрацией витаминов скорость их роста очень медленная.
1!ри вы15ащпвании укаэанных штаммов на той же среде с включением в нее раствора 3 стерилизо12 ванных витаминов при конечной концентрации биотина в культуре 50 мгк/л, скорость роста равна
0,2 а — 0,22 час, а с добавлением Оиоччеча 150 мгн/л) и хлористого холина (50 мг/л) — 0,27 час .
Формула изобретения
1. Способ получения протеинсодержащего вещества путем выращивания грибов pogaFusarium в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей источник углерода в виде утлевода, источник азота, минеральные соли и стимуляторы роста, с последующим выделением полученного продукта из культуральной жидкости, о т л и ч а ю щ и Й с я тем, что, с целью повышения качества полученного продукта, из грибов родаFusari um используют вид graminearum.
2, Способ по п.1, от лича ю щи и с я тем, что иэ вида гагг22г2earum используют штамм Schwabe. эа N0 1М1 14542>.
З..Способ по п,п.1,2, о тли ча ю щи и с я тем, что, из вида graminearum используют штаммы за
И0 1 41 154209 1М1 154211, 1М1 154212 1М1 154213
1М1 154210.
4. Способ по п и, 1 — 3, отличающийся тем, что выращивание проводят при рН преимущественно равном 3 5 7.
5. Способ но п п. 1 — 4, отличающийся тем, что, в качестве стимулятора роста используют биотин. б. Способно пи. 1 — 4, от лича ю щи и ся тем, что, в качестве стимулятора роста используют холин.
7. Способ по пп, 1 — б,отличающийся тем, что способ осуществляют при коэффициенте раэ«1 бавления среды предпочтительно равном 0,1 час .