Способ получения модифицированной панкреатической рибонуклеазы

Патент 540873

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

СПИ 111) 540873

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Сок)э Советских

Социалистических

Реслу6лнк (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 23.12.74 (21) 2087851/04 (51) М. Кл.- С 07G 7/00ii

С 07Н 1/ 00 с гр;1сосдиненисм заявки Ко

Госрдарстве)11)ый комитет (23) Приоритет

Совета Министров СССР о делам изобретений Опубликовано 30.12.76. Бюллетень М 48 (53) "ДК 547 965 02 (088.8) и открытий

Дата опубликования описания 08.02.77 (72) Авторы изобретения (71) Заявитель

Б. М. Куриненко и Н. В. Калачева

Казанский ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. В. И. Ульянова-Ленина (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОЙ

ПАН КРЕАТИЧЕСКОЙ РИБОНУКЛЕАЗЫ

Изобретение относится к области биохимии ферментов и касается способа получения модифицированного (иммобилизован ного) фермента панкреатической рибонуклеазы.

Для модификации панкреатической рибонуклеазы известны многочисленные приемы ковалентного связывания ее с различными полимерными матрицами (1). Для методов ковалентного связывания используют целый ряд активированных носителей. Среди них известна активация полимерной матрицы обработкой раствором хлористого N-(,11-нитробензилоксиметил)-пиридиния с прогреванием прп

125 С (2).

Однако в настоящее время отсутствуют данные о соотношении синтетазной и гидролазной активности для модифицированных форм фермента и влияния характера связывания фермента с полимерной матрицей на его синтетазную активность в реакциях синтеза олигонуклеотидов. Для нативных форм рибонуклеазы отношение «синтез/гидролиз» в реакциях полимеризации составляет, как правило, около единицы.

С целью получения модифицированной панкреатической рибонуклеазы с повышенной сингетазной активностью (т. е. увеличенным отношением «синтез/гидролиз») по предлагаемому способу для модификации рибонуклеазы используют новый метод ковалентного связывания ее с активированнымп матрицами через lc-аминобензилоксиметпльный радикал.

Отличительной особенностью предлагаемого способа является то, что панкрсатическую рп5 бонуклеазу подвергают взаимодействию с активированной водонерастворимой матрицейвЂ”

ХН -целлюлозой пли с актпвированной водорастворимой матрицей вЂ” ХН -полиглюкином при температуре от 0"С до 20 С. Матрицу ак10 тивируют обработкой раствором хлористого . - (11-пп гробепзилокси мсп1л) -и пр1)дип11я по известному способу.

У иммобилпзованпых препаратов рибонуклеазы определяют синтетазную активность.

15 Модификация рибонуклеазы состоит из двух стадий: акт11вацпп матрицы II связывания фермента.

Пример 1.

А. Активация водонерастворпмой матрицы.

2) 1 г целлюлозы смешивают с 200 мг хлористого N- (.1т-нитробензплокспметпл) -пиридинпя, растворенного в 2 мл 0,7%-ного раствора

СНаСООХа, высушивают в зкспкаторе и прогревают 40 мин при 125 С. Промывают водой, 25 бензолом и восстанавливают гидросульфитом натрия (30 мнн при 50 вЂ” 60 С). Вновь промывают водой, 30 /о-ной уксусной кислотой и снова водой.

300 мг ампноцеллюлозы охлахкдают в 3 мл

301 5 /о -ной НС1, при перемешпвапип добавляют

540873

Т аблица 1

PHK-аза, связанная с NH2-полиглюкином при

РНК-аза несвязанная, через, час

Продукты реакции

20 С

0 вЂ” 2 С через час через час

1 3 23

3 23

13,3

82,3

4,4

13,6

60,4

26,0 сс

С)р

С„ (цитидийфосфат) 16,2

54,0

31,8

33,0

53,8

13,2

1,3

96,1

2,6

28,5

67,0

4,5

19,4

24,5

56,1

3,0

93,7

3,3

14,2

80,3

5,0

Таблица 2

РНК-аза, связанная с NH,-целлюлозой

РНК-аза, несвязанная через, час

Продукты реакции при 20 С, через час при 0 вЂ” 2 С через, час

1 3 23

3 23

1 1 3 23

9,6

35,2

2,2

2,6

97,4

28, 15

58,3 13,5

2,1

97,9

5,0

93,8

1,2

29,4

24,5

56,1

1,8

97,0

1,2

16,2

54,0

31,8

13,6

60,4

26,0 с„с с>р ср

3 мл 4з -ного NaNOg в 5 /о-ной НС1, быстро промывают холодной водой.

Б. Связывание фермента с водонерастворимой матрицей.

1 мл раствора панкреатической рибонуклеазы в трис НС1-буфере (О 02 М, рН 7 3;

20 мг/мл) добавляют и диазотированной целлюлозе, перемешивают и добавляют 2 мл

0,2 М трис-НС1-буфера (рН 8,5). Смесь перемешивают 3 час и оставляют на ночь. Связывание проводят при 20"С. Аналогичным образом проводят связывание при О"С. Связанные препараты отмывают от несвязанных холодной водой.

Количество связанной рибонуклеазы по отношению к рибонуклеазе, взятой в реакцию, составляет для целлюлозы 40 вЂ” 500 .

Пример 2.

А. Активация водорастворимой матрицы.

1 r полиглюкина смешивают с 200 мг хлористого N-(и-нитробензилоксиметил) -пиридиния, растворенного в 2 мл 0,7%-ного раствора

СНз OONa, высушивают в эксикаторе и прогревают 30 мин при 1ОО вЂ” 110"С. Растворяют в воде и осаждают спиртом. Затем восстанавливают гидросульфитом натрия (30 мин при

50 вЂ” 60 С). Диализуют против воды, осаждают спиртом и высушивают эфиром.

300 мг аминополиглюкина растворяют в

3 мл 5 /о-ной НС1, охлаждают и добавляют при перемешивании 3 мл 4 /О-ного NANO, в

5%-ной НС1. Через 1 мин осаждают двойным объемом холодного спирта. Осадок снова обрабатывают спиртом, дважды эфиром, быстро высушивают и растворяют в 2 мл холодной воды.

Б. Связывание фермен" à с водорастворимой матрицей.

1 мл раствора панкреатической рибонуклеазы в трис-НС1-буфере (0,02 М рН 7,3, 5

20 мг/мл) добавляют к 2 мл диазотированного полиглюкина, перемешивают и добавляют

2 мл 0,2 М трис-НС1-буфера (рН 8,5).

Смесь оставляют на ночь.

Связывание гроводят при 20 С.

2,5 мл рибонуклеазы, связанной с аминополиглюкином, помещают на колонку с сефадексом L=100 и элюируют 0,02 М трис-НС1-буфером (рН 7,8) с 0,14 М NaC1.

Аналогичным образом проводят связываниее при 0 С.

Количество связанной рибонуклеазы составляет 20 вЂ” 25% по отношению к рибонуклеазе, взятой в реакцию.

У полученных связанных препаратов определяют содержание белка биуретовым методом.

Очищенные препараты анализируют на синтетазную активность.

Ниже приводится пример, иллюстрирующий повышение синтетазной активности.

Синтез дпцптндинмонофосфата (СрС) . Готовят реакционную смесь следующего состава:

Пгнкреатическая рибонуклеаза (РНК-аза)

0,8 мг/мл 0,02 мл

Цитидинциклофосфат (С) р) (Ха-соль) 12,о мкмоль 4,5 мг

Цитидин (С),37,5 мкмоль 9,2 мг

Трис-НС1-буфер 0,06 М, рН 7,6 0,03мл

Смесь инкубиру1от при О С. Через определенные промежутки времени (1 час, 3 час, 23 час) из реакционной смеси отбирают пробы по 0,003 мл, которые анализируют при помощи электрофореза на бумаге в триэтиламмонийбикарбопатном буфере (0,05 М, рН 7,5, /=0,5 ma/cì, V=1000 в). Индикацию пятен осуществляют по гашению флуоресценции в

УФ-свете. Вещество с бумаги элюируют 0,1 н.

НС1 Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при Х 280 нм.

540873

Таблица 3

Отно:пение СрС! Ср, и через промежутки времени, час

РНК-аза

0,5

PHK-аза панкреатическая

0,5

0,34

PHK-аза вЂ” NH ïoëèглюкин при 20 С

PHK-аза вЂ” NH -полиглюкин при 0 вЂ” 2 С

PHK-аза вЂ” NH,-целлюлоза при 20"C

PHK-аза вЂ” МН,-целлюлоза при 0 вЂ” 2 С

3,0

6,1

2,42

0,5

2,8

0,9

1,5

4,1

2,1

2,6

4,2

Составитель С. Чернова

Техред А. Камышникова

Редактор Г. Никольская

Корректор Л. Брахнина

Заказ 3010/5 Изд. № 1914 Тираж 575 Подписное

ЦНИИПИ Государственного кoмитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр., Сапунова 2

Выход продуктов реакции синтеза (%) несвязанной рибонуклеазы и связанной с NH>полиглюкином представлены в табл. 1.

Выход продуктов реакции синтеза несвязанной рибонуклеазы и связанной с ХНз-целлюлозой представлен в табл. 2.

Формула изобретения

Способ получения модифицированной панкреатической рибонуклеазы, включающий активацию матрицы хлористым N-(м-нитробензилокоиметил)-пиридинием при нагревании, отличающийся тем, что, с целью повышения синтетазной активности, панкреатичеокую рибонуклеазу подвергают взаимодействию с активированной водонерастворимой матрицей

NH>-целлюлозой или с активированной водорастворимой матрицей вЂ” ХН -полиглюкином при температуре 0 вЂ” 20"С.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Кестнер А. И., Успехи химии, 63, 1480 (1974), вып. 8.

2. Кур санов Д. П. и Солоднов П. Л. ж. прикл. химии, 16, 351, 1943.